细胞生物学-10真核细胞内膜系统、蛋白质分选与膜泡运输结果

第三节细胞内蛋白质的分选与膜泡运输,一、信号假说与蛋白质分选信号信号假说分泌性蛋白N端序列作为信号肽，指导分泌性蛋白到内质网膜上合成，然后在信号肽引导下蛋白质边合成边通过易位子蛋白复合体进入内质网腔，在蛋白质合成结束前信号肽被切除。信号肽位于蛋白质的N端，一般有16-26个氨基酸裂基，其中包括疏水核心区、信号肽的C端和N端3部分。,信号肽的一级序列信号肽一级序列由疏水核心（h）、C端（c）和N端（n）三个区域构成。以血清白蛋白和HIV-1型病毒的糖蛋白gp160信号肽为例，显示出两者的n区长度明显不同。,蛋白质分选信号细胞内合成的蛋白质、脂类等物质之所以能够定向的转运到特定的细胞器取决于两个方面：其一是蛋白质中包含特殊的信号序列，其二是细胞器上具特定的信号识别装置。信号肽信号识别颗粒（SRP）信号识别颗粒受体（停泊蛋白，DP）,在非细胞系统中蛋白质的翻译过程与SRP、DP和微粒体的关系,细胞类至少存在两类蛋白质分选的信号：信号序列：存在于蛋白质一级结上的线性序列，通常15-60个氨基酸残基，有些信号序列在完成蛋白质的定向转移后被信号肽酶切除。信号斑：存在于完成折叠的蛋白质中，构成信号斑的信号序列之间可以不相邻，折叠在一起构成蛋白质分选的信号。每一种信号序列决定特殊的蛋白质转运方向。目前对于信号斑了解较少，主要是因为它存在于复杂的三维结构中，很难将其分离出来研究。,分泌性蛋白的合成与其跨内质网膜的共翻译转运,二、蛋白质分选的基本途径和类型,共翻译转运途径翻译后转运途径,分泌蛋白的成熟过程,蛋白质的分选运输途径主要有四类：门控运输：如核孔可以选择性的主动运输大分子物质和RNP复合体，并且允许小分子物质自由进出细胞核。跨膜运输：蛋白质通过跨膜通道进入目的地。如细胞质基质中合成的蛋白质在信号序列的引导下，通过线粒体上的转位因子，以解折叠的线性分子进入线粒体。膜泡运输：蛋白质被选择性地包装成运输小泡，定向转运到靶细胞器。如内质网向高尔基体的物质运输、高尔基体分泌形成溶酶体、细胞摄入某些营养物质或激素，都属于这种运输方式。蛋白质在细胞基质中的运输（细胞骨架体系）。,三、膜泡运输,细胞内部内膜系统各个部分之间的物质传递常常通过膜泡运输方式进行。如从内质网到高尔基体，高尔基体到溶酶体，细胞分泌物的外排，都要通过过渡性小泡进行转运。膜泡运输是一种高度有组织的定向运输，各类运输泡之所能够被准确地运到靶细胞器，主要是因为细胞器的胞质面具有特殊的膜标志蛋白。许多膜标志蛋白存在于不止一种细胞器，不同的膜标志蛋白组合，决定膜的表面识别特征。,网格蛋白有被小泡网格蛋白有被小泡是最早发现的衣被小泡，介导高尔基体到质膜、胞内体、溶酶体或植物液泡的运输，以及质膜到细胞质、胞内体到溶酶体的运输。网格蛋白分子由3个重链和3个轻链组成，形成一个具有3个曲臂的形状。许多网格蛋白的曲臂部分交织在一起，形成一个具有5边形网孔的笼子。,网格蛋白有被小泡(电镜照片，分子模型，模型),网格蛋白有被小泡的形态,网格蛋白有被小泡中还有衔接蛋白（接合素蛋白），介于网格蛋白与配体受体复合物之间，起连接作用。目前至少发现4种不同类型的接合素蛋白，分别结合不同类型的受体，形成不同性质的转运小泡。当网格蛋白有被小泡形成时，可溶性蛋白动力素聚集成一圈围绕在芽的颈部，将小泡柄部的膜拉近（小于1.5nm），导致膜融合，动力素是一种GTP酶，调节小泡以出芽形式脱离膜的速率。动力素可以召集其它可溶性蛋白在小泡的颈部聚集，通过改变膜的形状和膜脂的组成，促使小泡颈部的膜融合，形成有被小泡。当有被小泡从膜上释放后，衣被很快就解体，网格蛋白返回被重新利用。,网格蛋白有被小泡的形成及选择性运输的组成,LDL通过受体介导的胞吞作用进入细胞,COP衣被小泡介导细胞内膜泡逆向运输，负责从顺面高尔基体网状区到内质网膜泡转运，回收、转运内质网逃逸蛋白返回内质网。起初发现于高尔基体碎片，在含有ATP的溶液中温育时，能形成非网格蛋白包被的小泡。内质网向高尔基体输送运输小泡时，一部分自身的蛋白质也不可避免的被运送到了高尔基体。内质网通过两种机制维持蛋白质的平衡：一是转运泡将应被保留的驻留蛋白排斥在外，例如有些驻留蛋白参与形成大的复合物，因而不能被包装在出芽形成的转运泡中，结果被保留下来；二是通过对逃逸蛋白的回收机制，使之返回它们正常驻留的部位。,内质网的正常驻留蛋白，不管在腔中还是在膜上，它们在C端含有一段回收信号序列，如果它们被意外地逃逸进入转运泡从内质网运至高尔基体cis面，则cis面的膜结合受体蛋白将识别并结合逃逸蛋白的回收信号，形成COPI衣被小泡将它们返回内质网。内质网腔中的蛋白，如蛋白二硫键异构酶和协助折叠的分子伴侣，均具有典型的回收信号Lys-Asp-Glu-Leu（KDEL）。内质网的膜蛋白（如SRP受体）在C端有一个不同的回收信号，通常是Lys-Lys-X-X（KKXX，X：任意氨基酸），同样可保证它们的回收。COPI衣被小泡还可以介导高尔基体不同区域间的蛋白质运输。,COP运输小泡的出芽过程一种胞质溶胶中的小分子GTP结合蛋白，即ARF，释放所结合的GDP，然后同GTP结合，形成ARF-GTP复合物，并整合在高尔基体膜中。GDP与GTP的交换是由高尔基体膜中的一种酶催化的。COP同ARF以及高尔基体膜蛋白的细胞质部分结合。在脂酰CoA的帮助下形成COP被膜小泡。COP小泡形成后立即从供体膜释放出来，COP包被去聚合，并与膜脱离，这一过程是由与ARF结合的GTP水解所触发。,在高尔基体膜中一种酶的催化下，ARF蛋白将所结合的GDP与GTP进行交换，出芽随即开始。ARF-GTP与高尔基体膜中ARF受体结合后，外被体与高尔基体的胞质溶胶面结合并聚合成纤维状外被体，诱导出芽形成小泡。在出芽形成小泡过程中，不仅将被运输的物质包进小泡，也包括其他一些膜蛋白，其中包括V-SNARE，它的作用是导航，指引小泡到达正确的目的地。脂酰CoA帮助小泡与供体膜脱离，随着GTP的水解小泡的外被解聚。,COP衣被小泡介导细胞内顺向运输，即负责从内质网到高尔基体的物质运输。最早发现于酵母ER在ATP存在的细胞质液中温育时，ER膜上能形成类似于COPI的衣被小泡，某些温度敏感型的酵母，由于COPII衣被蛋白发生变异，在特定温度下会在内质网中积累蛋白质。,COPII衣被小泡形成于内质网的特殊部位，称为内质网出口，这些部位没有核糖体，由交织在一起的管道和囊泡组成网络结构。由内质网到高尔基体的蛋白转运中，大多数跨膜蛋白是直接结合在COPII衣被上，但是少数跨膜蛋白和多数可溶性蛋白通过受体与COPII衣被结合，这些受体在完成转运后，通过COPI衣被小泡返回内质网。COPII衣被所识别的分选信号位于跨膜蛋白胞质面的结构域，形式多样。,COP小泡的装配需要一种称为Sar1的G蛋白的参与。当Sar1中GDP与GTP进行了交换，诱导Sec23和Sec24蛋白的结合，接着是Sec13和Sec31蛋白的结合，最后由一种结合在ER表面的大蛋白质，Sec16与Sec23/Sec24复合物、Sec13/Sec31复合物相互作用，装配成一个完整的小泡。在COP的小泡膜上有一个相对分子质量为24kDa的蛋白质帮助选择被运输的可溶性的ER蛋白。COP小泡装配时的识别信号是双酸性分选信号，如Asp-X-Glu。这种信号序列与COP的一个或多个亚基结合。从ER形成的COP小泡常常相互融合成大的运输小泡，这种大的小泡需要以微管作为运输轨道向高尔基体运输。说明：天冬氨酸和谷氨酸是酸性AA。,膜泡锚定与融合的特异性是通过转运泡膜上的蛋白和靶膜上的蛋白相互作用获得的。,膜泡运输的定向机制有被小泡沿着细胞内的微管被运输到靶细胞器，马达蛋白水解ATP提供运输的动力。各类运输小泡之所以能够被准确地和靶膜融合，是因为运输小泡表面的标志蛋白能被靶膜上的受体识别，其中涉及识别过程的两类关键性的蛋白质是SNAREs（solubleNSFattachmentproteinreceptor）和Rabs（targetingGTPase）。其中SNARE介导运输小泡特异性停泊和融合，Rab的作用是使运输小泡靠近靶膜。,SNAREsSNAREs的作用是保证识别的特异性和介导运输小泡与目标膜的融合。动物细胞中已发现20多种SNAREs，分别分布于特定的膜上，位于运输小泡上的叫作v-SNAREs，位于靶膜上的叫作t-SNAREs。v-SNAREs和t-SNAREs都具有一个螺旋结构域，能相互缠绕形成跨SNAREs复合体，并通过这个结构将运输小泡的膜与靶膜拉在一起，实现运输小泡特异性停泊和融合。在SNAREs接到新一轮的运输小泡停泊之前，SNAREs必须以分离的状态存在，NSF催化SNAREs的分离，它是一种类似分子伴娘的ATP酶，能够利用ATP作为能量通过插入几个适配蛋白将SNAREs复合体的螺旋缠绕分开。,JamesRothman和他同事对动物细胞融合研究发现，提出有关转运小泡寻靶的SNARE假说：每种转运小泡都有特异的v-SNARE，能识别并与靶膜上t-SNARE相互作用。通过v-SNARE与t-SNARE两类蛋白间的互补性和相互作用，决定供体膜泡在靶膜上的锚定与融合。也许会在其它膜位点进行暂时性接触，但不稳定。以确保转运小泡正确到达目的地。,T和VSNAR,SNAR复合体的解离,在神经细胞中SNAREs负责突触小泡的停泊和融合，破伤风毒素和肉毒素等细菌分泌的神经性毒素实际上是一类特殊的蛋白酶，能够选择性地降解SNAREs，从而阻断神经传导、精卵的融合、成肌细胞的融合均涉及SNAREs，另外病毒融合蛋白的工作原理与SNAREs相似，介导病毒与宿主质膜的融合。,RabsRab也叫targetingGTPase，属于单体GTP酶，结构类似于Ras，已知30余种。不同膜上具有不同的Rab，每一种细胞器至少含有一种以上的Rab。Rabs的作用是促进和调节运输小泡的停泊和融合。与衣被召集GTP酶相似的是，起分子开关作用，结合GDP失活，位于细胞质中，结合GTP激活，位于细胞膜、内膜和运输小泡膜上，调节SNAREs复合体的形成。Rabs的调节蛋白与其它G蛋白的相似。Rabs还有许多效应因子（effector），其作用是帮助运输小泡聚集和靠近靶膜，触发SNAREs释放它的抑制因子。许多运输小泡只有在包含了特定的Rabs和SNAREs之后才能形成。,Rab蛋白在小泡转运和融合中的调节机理可能是：供体膜上的鸟嘌呤核苷释放蛋白（GNRP）识别胞质溶胶中特异的Rab蛋白，诱导GDP的释放并和GTP结合，进而改变Rab蛋白的构型，改变了构型的Rab蛋白暴露出其脂基团，从而将Rab蛋白锚定到膜上。运输小泡形成后，在特异的v-SNARE的引导下，到达受体膜的t-SNARE部位，Rab帮助小泡与受体膜融合。Rab蛋白上的GTP水