第三章-细胞生物学研究方法1

第三章细胞生物学研究方法,进行初步观察,形成可验证的假说,设计对照试验,收集资料,解释结果,作出合理结论,查阅已有知识,生物学研究模式生物不同物种享有共同分子机制,Caenorhabditiselegans,Drosophilamelanogaster,Arabidopsisthaliana,细胞,破碎,细胞器,组份,形态观察,细胞培养,离心分离,染色,免疫技术,分子生物学,标记,掌握各种显微镜的用途、几种细胞组分的主要分析方法的原理及技术、细胞培养及细胞融合的方法了解电子显微镜的观察方法及显微操作技术的基本原理。,教学目的、要求,本章内容提要,第一节细胞形态结构的观察方法第二节细胞及其组分的分析方法第三节细胞培养与细胞工程,第一节细胞形态结构的观察方法,肉眼分辨率：0.2mm光学显微镜分辨率：0.2m电子显微镜分辨率：0.2nm,几种显微镜的分辨范围,一、光学显微镜,1.普通复式光学显微镜,2.荧光显微镜,4.激光共焦点扫描显微境,3.暗视野显微镜,5.相差显微镜,偏光显微镜,6.微分干涉差显微镜,7.倒置显微镜,各种光学显微镜的特性比较,当代显微镜的发展趋势,普通生物显微镜由三部分构成：照明系统光学放大系统机械装置原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。,1.普通复式光学显微镜,分辨率,N=介质折射率；=镜口角（标本对物镜镜口的张角镜口角总是要小于140，所以sina/2的最大值必然小于1。分辨力数值不会小于0.2m，人眼的分辨力为0.2mm,因此显微镜的最大设计倍数为1000X。,指显微镜能分辨物体最小间隔的能力。,样品的制作,制片：固定（甲酫）、包埋（石蜡）切成厚约5m的薄片以便观察。染色：伊红和美蓝特异地与不同蛋白质结合，品红特异地显示DNA的所在部位。,2.荧光显微镜Fluorescencemicroscope,特点：光源为短波光(紫外光)；有两个特殊的滤光片；用一定波长的光激发标本发射荧光,原理:利用一定波长的光,照射被检样品,激发荧光物质发出可见的荧光,视场中所见像主要是样品的荧光映像.自发荧光:生物体内有些物质受激发光照射后可直接发出的荧光.木质素,叶绿素次发荧光:标本本身不发荧光，经荧光染料处理后,那些对荧光染料有选择性吸收的部分经激发后发出的荧光.常用荧光物质：酸性品红，甲基绿，中性红，EB等。,4.激光共焦点扫描显微境（laserscanningconfocalmicroscopy,LCSM）,共焦点是指物镜和聚光镜同时聚焦到同一个小点，即它们互相共焦点。,LCSM,激光光源通过一个微小缝隙，打到一个二向色镜。由镜子反射的光线通过物镜、聚焦在样品的一个层面上。样品被激发后发出较长波长的光，通过物镜成像、聚焦在显微镜中的一个针孔缝隙中，而来自其它层面的光线被挡板挡住。图像通过信号放大传输到计算机中。,LCSM照片，蓝色为细胞核，绿色为微管,比普通荧光显微镜的分辨率提高1.4-1.7倍。由于可自动改变观察的焦平面而且纵向分辨率（axialresolution）得到改善，所以可以通过“光学切片”观察较厚样品的内部结构。将改变焦点获得一系列细胞不同切面上的图像，经叠加后便可重构出样品的三维结构。,相差显微镜(phasecontrastmicroscope),FritsZernike1953年Nobel物理学奖,1.分离直射光和衍射光2.使直射光和衍射光之间产生干涉，使相位差变成振幅差,表现为明与暗的对比,秀丽杆线虫C.elegans,用于观察未染色样品,能够观察到无色透明的活的物体。,相差显微镜,基本原理：把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高各种结构间的对比度，使各种结构清晰可见。在构造上，相差显微镜不同于普通光学显微镜两个特殊之处：环形光阑(annulardiaphragm)相位板(annularphaseplate)A+相板B+相板,5.微分干涉差显微镜Differentialinterferencecontrastmicroscope（DIC）,1952年Nomarski发明，利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。更适合研究活细胞中较大的细胞器。,组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。,6.倒置显微镜,各种光学显微镜的比较,当代显微镜的发展趋势,采用组合方式集普通光镜加相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体。自动化与电子化。,二、电子显微镜技术,透射电子显微镜扫描电子显微镜,1.原理：以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束波长与加速电压(通常50120KV)的平方根成反比。由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。用于观察超微结构（小于0.2m）。用于电镜的标本须制成厚度约50nm左右的超薄切片。,（一）、透射电子显微镜,电子显微镜与光学显微镜的基本区别,分辨本领光源透镜真空成像原理利用样品对波长的吸光学0.2m左右可见光收形成明暗反差和颜显微镜放大倍数1000400-700nm玻璃不要求色变化100nm紫外光电子利用样品对电子的显微镜0.1-0.2nm电子束0.01-0.9nm电磁要求散射和透射形成明暗反差电镜需要真空的原因:1.如果含有其他分子,会与电子发生碰撞,使电子散射,影响成像质量,2.碰撞也会使电子束不稳定,产生闪烁现象,3.灼热的灯丝遇气体易腐蚀和断裂.,2、制样技术,超薄切片负染技术冰冻蚀刻,电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机ultramicrotome）制作。通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。,超薄切片,Page59,超薄切片技术主要包括取材、固定、包埋、切片、染色等步骤。,Electronmicrographofaroot-tipcellstainedwithosmiumandotherheavymetalions.Thecellwall,nucleus,vacuoles,mitochondria,endoplasmicreticulum,Golgiapparatus,andribosomesareeasilyseen.,负染技术,用重金属盐(如磷钨酸)染色；吸去染料干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。,NegativeStainedArchaebacteria,NegativeStainedActin,冷冻蚀刻freeze-etching,标本置于干冰（-78.5摄氏度）或液氮（-196摄氏度）中冰冻。用冷刀骤然将标本断开，然后升温，冰升华，暴露断面结构。向断面喷涂一层蒸汽铂和碳。然后用次氯酸钠将组织溶掉，把铂和碳的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。,Page61,酵母细胞,4.电镜三维重构技术该技术是电子显微术、电子衍射与计算机图像处理相结合而形态的具有重要应用前景的一门新技术，尤其适于分析难以形成三维晶体的膜蛋白以及病毒和蛋白质-核酸复合物等大的复合体的三维结构。,扫描电子显微镜（scanningelectronmicroscope，SEM）于20世纪60年代问世，用来观察标本的表面结构。,（二）、扫描电子显微镜,工作原理,用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。,antigen-presentingcells，APCs,扫描电镜,电镜,光镜,总体形态颜色内部结构表面形态,三、扫描隧道显微镜,扫描隧道显微镜（scanningtunnelingmicroscope，STM）由Binnig等1981年发明，根据量子力学原理中的隧道效应而设计。利用扫描隧道显微镜直接观察生物大分子，如DNA、RNA和蛋白质等分子的原子布阵和某些生物结构，如生物膜、细胞壁等的原子排列分辨率：横向为0.10.2nm，纵向可达0.001nm。用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。,STMimageofaDNAmolecule,第二节、细胞组分的分析方法,一、离心技术,是分离细胞器及各种大分子基本手段。转速为1025kr/min的离心机称为高速离心机。转速25kr/min，离心力89K者称为超速离心机。超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500Kg。,1.差速离心Differentialcentrifugation,特点：介质密度均一；速度由低向高，逐级离心。用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。沉降顺序：核线粒体溶酶体与过氧化物酶体内质网与高尔基体核蛋白体。可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再进行分离纯化。,利用肝脏制备各种亚细胞组分的制备离心过程示意图,2.密度梯度离心,用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞和细胞成分分层、分离。类型：速度沉降、等密度沉降。常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。,速度沉降velocitysedimentation,用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。特点：介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。,等密度沉降isopycnicsedimentation,用途：分离密度不等的颗粒。特点：介质密度高，陡度大，介质最高密度大于被分离组分的最大密度。力场比速率沉降法大10100倍，需要高速或超速离心。原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。,差速离心,密度梯度离心,CsCl密度梯度离心,蔗糖密度梯度离心,二者结合,二、细胞组分显示方法,组织化学或细胞化学染色（histochemicalorcytochemicalstaining）是利用染色剂可同细胞的某种成分发生反应而着色的原理，对某种成分进行定性或定位研究的技术。利用这种方法对细胞的各种成分几乎都能显示，包括有机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等。,1.固定物理固定：血膜空气快速干燥、冷冻干燥。化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂。显示多糖常用乙醇固定，显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定。,步骤：,2.显示方法金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CuS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。Schiff反应：细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。联苯胺反应：过氧化酶分解H202。产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。茚三酮反应：显示蛋白质。,金属沉淀法,Schiff反应,联苯胺反应,脂溶染色法,E.茚三酮反应：显示蛋白质。,免疫细胞化学是根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原结合，对抗原进行专一定位测定的技术。如果将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。,免疫细胞化学(immunocytochemistry),三、特异蛋白抗原的定位与定性,抗体与抗原的结合方法可分为以下两种：,直接法,间接法,将带有标记的抗体与抗原反应，显示出抗原存在的部位,间接免疫细胞化学法的原理示意图,第一抗体（一抗）,第二抗体（二抗）,三、特异蛋白抗原的定位和定性,1.免疫荧光技术Immunofluorescencetechnique：抗原-抗体特异结合与荧光标记技术相结合用于研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。,用Alexa488标记的抗人-tubulin抗体染色显示微管(绿色);细胞核:红色,DAPI染色(常规荧光显微镜照片，ShiQinghua等),用抗-tubulin抗体染色显示微管(绿色);细胞核:红色,DAPI染色(激光共聚焦显微镜照片),2.免疫电镜技术Immuneelectronmicroscopy：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等,用免疫电镜方法,观察到寇氏隐甲藻的多条凝集染色体和细胞中的金颗粒,并且细胞核内、核膜上的金颗粒簇集相对于胞质中相对集中,指示了ACA抗CJFD2003,四、细胞内特异核酸序列的定位与定性,通常用*原位杂交：指用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或者在细胞中的位置的方法。,五、放射自显影术,用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光。一般用14C和3H标记。常用3H-TDR来显示DNA，用3H-UDR显示RNA；用3H氨基酸研究蛋白质，用3H甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。14C半衰期为5730年，3H为12.5年。,1.流式细胞技术,用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计（flowcytometer）。,六、定量细胞化学分析技术,2.显微光谱分析技术,细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线。可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定性和定量测定。,第三节细胞培养与细胞工程,一、细胞培养二、细胞工程,一、细胞培养,(一)、动物细胞培养,选用最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。动物细胞的生存环境与植物细胞差别很大，因而二者的培养方法很不相同。,(一)、动物细胞培养,1.基本概念原代细胞(primaryculturecell)从动物机体取出的进行培养的细胞群。有人也把培养的第2代细胞与传10代以内的细胞统称为原代培养细胞。有限细胞系(finitecellline)从原代细胞群中筛选出的仍保持原来染色体的二倍体数量及接触抑制性，能够繁殖40-50代左右的传代细胞。,永生细胞系(infinitecellline)细胞发生遗传突变，并带有癌细胞的特点，可能在培养条件下无限制地传代下去，这种传代细胞称为永生细胞系。如：HeLa细胞系、BH