细胞生物学：常规制片技术

组织学常规制片基本技术,组织学制片方法,切片法非切片法1.分离标本2.活体标本3.涂片标本,4.磨片标本5.整体封藏标本6.铺片标本7.组织印片,巨噬细胞（macrophage),精子,石蜡切片HE染色制片方法,动物致死和取材致死方法：麻醉、空气栓塞、股动脉放血等。,HE染色,取材顺序：先腹腔（肝脏、胆囊、肾、肾上腺、胰腺、脾、胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠），然后取胸腔和盆腔内的器官组织。,取材关键材料新鲜勿使组织块受挤压组织块力求小而薄选好组织块的切面尽量保持组织的原有形态保持材料的清洁,固定和固定液,固定：借助化学药品使组织和细胞中的有机和无机成分凝固成沉淀，防止发生死后组织变化，以保持其生活时状态的过程。此药品称为固定剂。,目的和意义保持组织和细胞与正常生活时的形态相似。使细胞内的各种成分转变成不溶性物质。,增加组织硬度，便于组织切片。防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有的形态结构。,固定的对象和方法小块组织固定法注射、灌注固定法蒸汽固定法,固定剂的性质和条件迅速渗入组织而固定细胞质。有较强的渗透力。避免死后变化。避免过度膨胀或收缩。,注意事项组织必须新鲜组织的厚度防止因固定发生变形用量时间促使固定,固定剂单纯固定剂甲醛渗透力强，固定均匀，对组织收缩少。经甲醛固定的组织，细胞核染色甚佳，胞质着色较差。除单独使用外，常与其他药品配成混合液，效果更佳。,氧化汞俗称升汞，剧毒，必须严格保管和注意使用。穿透力慢，适于固定薄块组织。能沉淀一切蛋白质，升汞可增加对酸性燃料的亲和力，如卡红等。,醋酸又名乙酸、冰醋酸，为无色透明液体，有刺激性气味。醋酸的渗透力强。经单纯醋酸固定的组织，可不经水洗，直接入酒精脱水。用作固定剂的醋酸浓度一般在0.3-5%。,苦味酸黄色粉末结晶。能沉淀蛋白质，对脂肪类脂无效，渗透力较弱，一般很少单独使用。,乙醇又名酒精，为无色液体，可与水在任何比例下相混合。一般用作固定液的浓度为95%或纯酒精。其他常用的单纯固定剂还有重铬酸钾、铬酸、四氧化锇、丙酮、三氯乙酸等。,常用混合固定剂Bouin氏液配方：苦味酸饱和水溶液75ml；甲醛25ml；冰醋酸5m。此液临用时配制。为一种常用良好的固定液，渗透力强，对组织固定均匀，收缩较小，染色效果好。一般组织固定12-24小时。,Carnoy氏液配方：纯酒精60ml；冰醋酸10ml；氯仿（三氯乙酸）30ml。此液渗透迅速。适用于一般细胞学研究。固定后不经水洗，即入95%酒精脱水或直接入纯酒精，可缩短制片时间。,Zenker氏液配方：升汞5g；重铬酸钾2.5g；冰醋酸5ml；蒸馏水100ml。为组织学、细胞学及病理学常用的固定剂，多用于固定一般组织。固定时间24小时，加热固定可以加快渗透作用。固定后流水冲洗12小时，并在以后的脱水过程中除去汞盐沉淀。,其他常用的混合固定液有中性甲醛固定液、甲醛-乙醇固定液、Helly固定液等。,洗涤,目的组织在固定后一定要把渗入组织里面的固定液洗去，防止组织中留有较多的固定液而影响脱水剂，甚至可在组织中发生沉淀或结晶而影响观察。常用方法固定剂以水配制的固定剂含乙醇的,脱水,目的和原则组织经固定和水洗后，含有大量的水分，而水和苯及石蜡根本不相融合，所以组织在透明前必须经过脱水这一环节。就是用某些溶剂逐步将组织块吸收的水分置换出来，以利于透明剂和石蜡等的渗入，这一过程就叫做脱水，使用的药品为脱水剂。,种类非石蜡溶剂的脱水剂石蜡溶剂的脱水剂方法将脱水剂配成各种浓度，自低到高浓度循序进行。,常用脱水剂酒精为常用的脱水剂。脱水能力强，并能使组织硬化，能较好地与二甲苯透明剂相融合。其缺点是易使组织收缩，变脆。在一般脱水过程中，采用循序渐进的方法，逐步升级，经一系列的不同浓度的酒精，使组织中的水分逐渐被酒精所替代。,丙酮脱水作用比乙醇强，但对组织块的收缩较大，价格较高，一般少用。主要用于快速脱水或固定兼脱水。正丁醇脱水能力较弱，但能与水、乙醇及石蜡相混合，故这种脱水的组织块可直接浸蜡包埋。这种脱水剂兼透明剂的最大优点是很少引起组织块的收缩与变脆。正丁醇在使用时易挥发，吸入后能发生头痛，使用时应注意安全。,时间：脱水时间应根据组织的体积和厚度而定，组织在纯酒精中脱水时间不能过长，过长则组织过度硬化变脆，不易切片。此外，脱水的时间与固定液的种类也有关。如用酒精脱水，一般经水洗的小块组织可从50%开始，依次经过70%、80%、95%I、95%II、100%I和100%II，每一级酒精脱水时间约为30分钟。简便的酒精稀释法：无论任何浓度的酒精稀释时，需稀释到多大浓度就取多少毫升酒精，然后用蒸馏水加至该酒精原有浓度即可。例：将95%酒精稀释为70%浓度时，则将95%酒精70毫升倒入量筒中，然后加入蒸馏水至总量95毫升即可。,简便的酒精稀释法：无论任何浓度的酒精稀释时，需稀释到多大浓度就取多少毫升酒精，然后用蒸馏水加至该酒精原有浓度即可。例：将95%酒精稀释为70%浓度时，则将95%酒精70毫升倒入量筒中，然后加入蒸馏水至总量95毫升即可。,透明,目的一、组织块透明的目的是便于浸蜡包埋，但组织块脱水后其内部的脱水剂与石蜡不相溶，还必须用石蜡诱导剂过度，这种物质能够同时溶解于脱水剂及包埋剂中，它能逐渐渗入组织最终将脱水剂完全排出，诱导剂渗入后，组织块往往呈透明状故称之为“透明”。这种药剂称为透明剂。二、切片透明的目的是有利于光线的透过，便于显微镜的观察。当组织块中全部为透明剂占有时，光线可以透过，组织可呈现不同程度的透明状态。,透明剂的种类和使用方法二甲苯易挥发，无色透明液体，长期接触对呼吸道粘膜有刺激作用。透明能力强，但易使组织收缩、变脆，所以组织块在二甲苯中不宜久留。时间二甲苯I、II各15-30分钟。,浸蜡和包埋,目的浸蜡是为包埋做准备，目的是除去组织中的透明剂而代之以石蜡，并渗入组织内部（因透明剂和石蜡相溶的性质，将透明的组织投入溶化的石蜡中，石蜡即浸入组织），把软组织变为适当硬度的蜡块，便于切成薄片。,方法将组织块经过二甲苯透明后，投入到已溶化的石蜡中。在透蜡时必须经过数次纯石蜡（石蜡1、2、3），使石蜡中存有的剩余透明剂完全去尽，以免影响切片质量。,时间透蜡时间应根据不同组织类型及其大小而定，基本上与组织固定时间成正比。最好先入1/2石蜡（含1/2二甲苯），然后入石蜡I、II，总时间不超过1小时。,浸蜡剂的种类石蜡有高熔点和低熔点之分，一般应用熔点为56。C以上的石蜡。低熔点在54。C以下，用于酶的显示和保存抗原活性。经过浸蜡的组织被包埋起来，有利于组织切片的连续性，展片平整，烤片方便，结构成分保存较好，特别是整个蜡块的材料保存可靠。火棉胶明胶,包埋,目的将组织埋入石蜡等凝固成块。方法石蜡包埋法先在纸制的小长形盒或金属包埋框内倒入融化的蜡，用加温的镊子将浸蜡的组织块置于其内。放入时应注意组织的切面朝下并放平整；石蜡的温度不宜过高而损伤组织，过低使组织和石蜡不适宜而影响切片。组织包埋好后，等到石蜡凝固，将包埋框打开，用刀片把组织蜡块切开，待完全冷却后再修整蜡块，要求组织外围的石蜡保留适中以便连续切片。,注意事项包埋时夹取组织的镊子，应随时烤热。包埋操作要敏捷。包埋后的蜡块应呈均质半透明状。包埋恒温箱中的温度必须保持恒定。若包埋后发现渗蜡不够，或包埋的不好，可将蜡块熔化，重新渗蜡和包埋。,组织切片,切片机制作组织切片标本必备的紧密仪器，可以制出以微米为单位的薄切片。,种类石蜡切片机火棉胶切片机冰冻恒温箱切片机保养,切片方法石蜡切片法包埋好的蜡块，切片前，将蜡块从包埋纸盒中取出并修整蜡块，用切蜡刀视组织大小，切去边缘余蜡的一部分，但应在组织的周边留有石蜡边0.2cm，蜡块的四边留蜡的距离要均等，不能一边多，一边少，否则将使连续切片受到影响，修整好的蜡块可放在冰箱中备用。准备好切片用具磨好的切片刀，毛笔一支，小手术刀一把，盛蜡片盘，二甲苯或氯仿一小瓶，药棉等，夏天还要准备冰块。,将修整好的蜡块固定在持蜡器（木块）上。用一小铜片铲加上石蜡，加热至70-80C，先倒一部分融化的蜡液于木块上，并将蜡块略融化后与之融合，冷却后，蜡块可牢固地粘附在持蜡器上。也可不用持蜡器，即将修整好的蜡块，经冷冻后，直接安装在切片机的组织块支持器中进行切片，当然如果蜡块太小，还须用持蜡器。,将修整好的持蜡器上的蜡块，再安装到切片机的蜡块夹持器上固定。将切片刀装在切片机的夹刀座上，并把刀座上的螺旋旋紧，以固定切片刀。切片刀与蜡块应保持一定的角度，将刀座下部前后移动，以调整好切片刀与蜡块的距离。,调整切片机厚度调节器所需的厚度。切片机上各部件调节好后，便开始切片，用右手握住切片机旋转轮的手柄，摇动旋转轮进行切片。冰冻切片法组织块不经任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却后再进行切片。火棉胶切片法,粘片,将切片机切下的蜡片，贴附在载玻片上的过程。粘片剂蛋白甘油用具洁净的载玻片，酒精灯或切片伸展器，拨针等。方法直接贴片法温水漂浮贴片法,烤片,温度一般在37-45。C，时间不少于24小时，以防切片从载玻片上剥离。,染色,染料原理：对纤维或组织有亲和力。根据其酸碱度不同，把染料分为酸性和碱性染料。细胞核的主要成分是DNA，带负电荷的磷酸基，所以细胞核能接受碱性染料。细胞质的成分主要是蛋白质，还有RNA、脂蛋白等，大多是两性离子化合物，当溶液PH低于其等电点时，胞质中蛋白质等带正电荷的与带负电荷的酸性染料结合。,苏木精伊红染色（HE染色）应用两种染料，一种是天然的苏木精，另一种是煤焦油染料伊红。苏木精主要用于对细胞核的染色，伊红主要用于对细胞质的染色。,苏木精配方（Harris苏木精）A液（苏木精1克，无水酒精10ml）B液（钾明矾20克，蒸馏水200ml）先将A液搅拌溶解，再将B液煮沸溶化去火，缓缓加A液，然后加氯化汞0.5克，再煮沸冷却后加入8ml冰醋酸，过滤后使用，存放时间越长，颜色越鲜艳。,伊红配方1%伊红：95%酒精100ml中含1克伊红。,HE染色,染色的步骤：1.脱蜡到水（1）石蜡切片烤干后，浸入二甲苯I20分钟，洗去石蜡。（2）浸入二甲苯II1分钟。（3）纯酒精I1分钟，洗去二甲苯。（4）纯酒精II1分钟。（5）按顺序入95%、80%、70%、50%酒精各1分钟。（6）蒸馏水中洗1分钟，洗去酒精。,2.染色、脱水（1）苏木素染细胞核，5-30分钟。（2）自来水洗去浮色，流水冲洗20分钟。（3）1%盐酸酒精分色。（4）蒸馏水洗。（5）入1%伊红水溶液或酒精溶液复染1-10分钟。（6）按顺序经95%酒精I、II中脱水各1分钟。(7)纯酒精I、II各2分钟。,13.透明、封固（1）1/2二甲