第三章-细胞生物学研究方法 1课件

1,第三章细胞生物学研究方法,2,细胞形态结构的观察方法细胞组分的分析方法细胞培养、细胞工程与显微操作技术用于细胞生物学研究的模式生物,3,细胞形态结构的观察方法,光学显微镜技术（lightmicroscopy）电子显微镜技术(Electromicroscopy)扫描探针显微镜（ScanningProbeMicroscope）扫描遂道显微镜(scanningtunnelingmicroscope),4,显微镜的分辨率：,肉眼：0.2mm;光镜：0.2um;电镜：0.2nm,5,一、光学显微镜技术（lightmicroscopy),普通复式光学显微镜技术荧光显微镜技术（FluorescenceMicroscopy）相差显微镜（phase-contrastmicroscope）微分干涉显微镜（differentialinterferencecontrastmicroscope,DIC）录像增差显微镜技术（video-enhancemicroscopy）激光共焦扫描显微镜技术（LaserConfocalMicroscopy）,6,普通复式光学显微镜技术,1.构成：照明系统：光源、聚光镜、反光镜光学放大系统：目镜、物镜机械装置：镜座、镜柱、镜臂、镜筒、调焦装置、载物台（物镜转换器）2.原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。,7,8,显微镜物像是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力（resolution）有关。分辨率是指区分开两个质点间的最小距离,=光源的波长；N=介质折射率；=镜口角（聚焦点对物镜镜口的张角。,9,荧光显微镜技术（FluorescenceMicroscopy）,原理：细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜可对这类物质进行定性和定量研究。光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜。是目前在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位最有力的工具。应用免疫荧光技术荧光素直接标记技术,10,荧光显微镜成像原理,11,荧光显微镜及其照片,荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）,尼康E800荧光DIC显微镜,12,正置显微镜,倒置显微镜,13,相差显微镜（phase-contrastmicroscope）将光程差或相位差转换成振幅差，可用于观察活细胞微分干涉显微镜（differential-interferencemicroscope）偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究活细胞中较大的细胞器图录像增差显微镜技术（video-enhancemicroscopy）计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活细胞中的颗粒及细胞器的运动,14,暗视野成像原理,15,16,17,AcomparisonofyeastcellsthatweregrowingonthevaginalepitheliumseenwithdifferenttypesofLM.a)underbright-field;b)phase-contrast;c)DIC,18,19,激光共焦扫描显微镜技术（LaserScanningConfocalMicroscopy）,原理和应用：激光共聚焦扫描显微镜（laserconfocalscanningmicroscope）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内，调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机重新组合，就能显示细胞样品的立体结构，给出细胞内各部分之间的定量关系及各种结构线度。激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的定量。优点：排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率(1.41.7)，可重构样品的三维结构。,20,激光共聚焦扫描显微镜,共聚焦显微镜及其显微图像,21,激光共聚焦原理,22,荧光共振能量转移（FRET）技术,是检测活体中生物大分了纳米距离和纳米距离变化的有力工具，可用于检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在直接的相互作用。FRET现象：当供体发射的荧光与受体发色团分子的吸收光谱重叠，并且两个探针的距离在10nm以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，称FRET现象。采用融合表达方式，可将两个蛋白的距离拉近于510nm。FRET效率反映了被检的两种蛋白是否直接作用及作用的强弱。,23,FRET原理图,24,与融合蛋白表达检测FRET,25,荧光漂白恢复技术,又称光脱色恢复技术，可用于检测活体细胞表达或细胞内部的分子运动以及在各种结构上分子动态变化率的大小。原理：利用高能量激光束的照射使特定的区域的荧光发生不可逆的淬灭，光漂白区荧光的忧复可通过非漂白区的荧光标记分子在膜上或胞质中运动至光漂白区来完成。,26,荧光脱色恢复技术（FRAP）,27,二、电子显微镜技术,电子显微镜的基本知识电镜与光镜的比较电镜与光镜光路图比较电子显微镜的基本构造主要电镜制样技术超薄切片技术负染色技术冰冻蚀刻技术电镜三维重构技术扫描电镜（Scanningelectronmicroscope，SEM）SPM(Scanningprobemicroscope),28,电镜种类,透射电子显微镜扫描电子显微镜扫描隧道显微镜,29,电镜与光镜的比较,30,电镜与光镜光路图比较,31,电子显微镜的基本构造,32,JEM-1011透射电子显微镜,透射电镜及其图像,33,主要电镜制样技术,超薄切片技术用于电镜观察的样本制备。通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片，切片厚度20-50nm。负染色技术（Negativestaining）与金属投影用重金属盐染色背景，衬托出样品的精细结构,34,超薄切片技术,35,Examplesofnegtivelystainedandmetal-shadowedspecimens.Electronmicrographsofatobaccorattlevirusafternegtivestainingwithpotassiumphosphotungstate(a)orshadowcastingwithchromium(b).,负染色技术,36,冰冻蚀刻技术（Freezeetching）冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。电镜三维重构技术电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学（StructuralBiology）主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。,37,冰冻蚀刻技术,38,电镜三维重构技术,39,扫描电镜（scanningelectronmicroscope，SEM）,原理与应用：扫描电子显微镜于20世纪60年代问世，用来观察标本的表面结构。工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。CO2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力问题。,40,JEOL扫描电子显微镜,扫描电镜及其图像,人类血细胞SEM照片,41,三、扫描遂道显微镜,ScanningProbeMicroscope,SPM(80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器)包括：STM、AFM、磁力显微镜、摩擦力显微镜等原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，如量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等，并在计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。,42,装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示系统。特点：（1）可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，且分辨本领高。（侧分辨率为0.10.2nm，纵分辨率可达0.01nm）；（2）可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息；（3）可在真空、大气、液体等多种条件下工作；非破坏性测量；（4）可连续成像，进行动态观察。用途：纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的结构。,43,44,第二节细胞组分的分析方法,离心分离技术细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法特异蛋白抗原的定位与定性细胞内特异核酸的定位与定性放射自显影技术定量细胞化学分析技术,45,一、离心分离技术,用途：离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体等细胞器，以及各种大分子基本手段。一般认为，转速为10000-25000r/min的离心机称为高速离心机；转速超过25000r/min，离心力大于89K者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达80000r/min，离心力超过500Kg。,46,高速、超速和梯度密度离心分离各种细胞器、生物大分子及其复合物,47,差速离心（Differencialcentrifugation）：在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。密度梯度离心：用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。用于精细组分或生物大分子的分离。,48,差速离心,密度梯度离心,49,50,二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法,原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。,DNA：福尔根（Feulgen）反应紫红色多糖类：PAS反应黄色脂肪：苏丹III红色蛋白质：米伦（Millon）红色,51,1.金属沉淀法：利用金属化合物在反应过程中生成有色沉淀，借以辨认所检查的物质或酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。2.偶氮偶联法：酚类化合物与偶氮染料结合后可以形成耐晒染料。3.Schiff反应：细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。这种反应通常用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。,52,4.联苯胺反应：过氧化酶分解H202。产生新生氧，后者再将无色的联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。5.普鲁士蓝反应：三价铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝。6.Formazane反应：显示脱氢酶。,53,7.“Nadi”反应：显示细胞色素氧化酶。8.脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。9.茚三酮反应：显示蛋白质。,54,三、特异蛋白抗原的定位与定性,免疫荧光技术：根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，并标上标记荧光素，对抗原进行定位测定的技术。快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限。蛋白电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹反应(Western-Blot),55,免疫荧光技术,56,免疫电镜技术：能有效提高样品的分辨率，在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位。免疫铁蛋白技术免疫酶标技术免疫胶体金技术应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等,57,免疫电镜技术,58,四、细胞内特异核酸的定位与定性,光镜水平的原位杂交技术（同位素标记或荧光素标记的探针）电镜水平的原位杂交技术（生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）PCR技术聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）,59,原位杂交技术,60,五、放射自显影技术（radioautography；autoradiography)）,原理及应用：其原理是将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内(标记），经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。然后经过显影、定影处理显示还原的黑色银颗粒，即可得知标本中标记物的准确位置和数量，放射自显影的切片还可再用染料染色，这样便可在显微镜下对标记上放射性的化合物进行定位或相对定量测定。还可实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。,32P（14D）,14C（5760Y）,3H（12Y）,35S（87D）,131I（8D）,61,放射性自显影技术,62,六定量细胞化学分析技术,流式细胞仪（FlowCytometry）主要应用：用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；分离DNA含量不同的中期染色体。,63,64,流式细胞术,65,细胞显微分光光度术（Microspectrophotometry）利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。包括：紫外光显微分光光度测定法可见光显微分光光度测定法,66,细胞培养、细胞工程与显微操作技术,细胞的培养细胞工程,67,一、细胞的培养,动物细胞培养类型：原代培养细胞（primaryculturecell）继代培养细