二代测序简介.ppt

,第二代测序技术简介,公司理念：毅新兴业以生命科学研究为本，致力于科学技术服务，为客户提供完美的科研平台。,基因组SNPs（包括芯片、massarray）第二代大规模测序病毒包装miRNA表达谱蛋白组血清多肽谱2DELC-MS（Shotgun法）代谢组NMRLC-MS,自主仪器恒温金属浴梯度PCR仪恒温振荡仪Squenom质谱仪SAI质谱仪MALDITOF/TOF测序仪：PolonatorG.007,试剂自主研发液体蛋白磁珠SBI试剂慢病毒RNA干扰库MicroRNA研究干细胞研究,3,内容提纲,从Sanger法到新一代测序技术第二代测序平台介绍第二代测序技术应用宏基因组学（Metagenomics）泛基因组学（Pangenomics）,KeyGenomicsTechnologies,1975-SouthernDNAhybridizationtechnique1977-Sangerschain-terminationandMaxam、GilbertschemicalDNAsequencingmethods1980-Automatedinsituoligonucleotidesynthesisinstrument1985-MullissdiscoveryofPCRatCetus1992-Affymatrix(Fodorsgroup)firstgene-chip1995-ABIsfirstautomatedDNAsequencer2006-2ndgenerationDNAsequenceronmarket2007andbeyondSinglemoleculesequencingtechniques,SangersMethod,Labeledprimer(1)Sequencereactions(4)Sequenceseparations(4)Sequenceread-out,1st-GenerationAutomatedDNASequencer,Parallelrunson96capillariesonABI3700,Limitationof1stGenSequencer,ThroughputTime-consumingseparationofchain-terminatedfragmentsHardtoproducemassivelyparallelsystembasedelectrophoreticseparationSequencingCostSamplehandlingDifficulttominiaturize,NeedforFasterandCheaperSequencingTechnology,PersonalGenomeProject,TrendsinNext-GenerationSequencing,Large-scaleandhigh-throughputAmplificationonsolidsurfaceClustergeneration(bridgeorpolonyamplification)EmulsionPCR(fragmentonbeads)InsitusequencingbychainextensionSequencebysynthesisDNApolymeraseSequencebyligationDNAligaseMassivelyparallelprocessingArrayofclusters,beadsMiniaturizationthroughmicrofluidicSinglemoleculedetection,测序技术目标,陈竺，日本血吸虫基因组,人类全基因组测序的目标：1000美元/人2008年预测5年内实现,2006年底，美国X大奖基金会设立了基因组ArchonX大奖，奖金高达1000万美元。这项大奖将颁给第一个能在10天之内，用不到100万美元的费用，完成100个人类基因组测序的团队。附加条件是覆盖率不小于98%，误差不大于1/100000bp。,Next-GenPlatforms,GAIllumina/SolexaSBSwithreversiblefluorescentterminatorsGSFLXRoche/454LifeSciencesSBSthroughpyrosequencingSOLiDABI/AgencourtSBLwithdualbaseencodingPOLONATORDanaherMotionSBLwithbaseencoding,Next-GenSequencingWorkflow,FragmentLibraryPreparationRandomPair-end,2ndGenerationPerformance,Roche/454LifeSciencesGenomeSequencer,Roche/454Workflow,DNALibraryPrepDNAFragmentEndrepairedAsymetricAdaptorsligated(onebiotinylated)ImmobilizedonstreptavidincoatedmagneticbeadsDenatured-sstemplateDNAlibraryPurified,EmulsionAmplificationTemplateDNAimmobilizedonprimercoatedcapturebeadsthruhybridization(1fragmentoneachbead)Thermocyletoamplify(forwardprimerisbiotinylated)Amplifiedbeadsenrichedwithstreptavidincoatedmagneticbeads,Roche/454Workflow,BeadDepositionOneamplifiedbeadpermicrowellFollowedbyenzymebeadsandpackingbeadsEnzymebeadsSulfurylaseLuciferasePackingbeadshelptokeepDNAbeadinmicrowell,Pyrosequencing4nucleotidessequentiallyflowinIncorporationofanucleotidereleasesapyrophosphate(PPi)SufurylaseconvertPPiintoATPATPhydrolizedbyluciferaseusingluciferintoproducelight,Pyrosequencing,ConvertPPitoATP,UseATPtogeneratelight,Remove(d)NTPsandexcessATP,Roche/454Workflow,ImageAcquisitionByCCDcameracoupledtothepicotiterplateChemiluminescentintensityreflectsnumberofnucleotideincorporatedineachflow;usedtodeterminehomopolymerregionUpto100cyclesrepeated,Post-acqProcessingDenovosequencingResequencingAmpliconvariantanalysis,ImageProcessingChemiluminescenteventmapedtowellFlowgramgeneratedforeachwellBasecalled,Roche/454LifeSciencesGenomeSequencer,速度快，一个测序反应耗时10个小时，获得100余万个读长和4-6亿个碱基对。测序读长最长，单个序列的读长更长，平均可达到400-500个碱基左右准确度高，读长超过400bp时，单一读长的准确性可以超过99%；一致性好，测序结果一致性超过99.99%；可以进行PairEnd测序研究；,功能强大的基因组分析工具PolonatorG.007,Polonator系统是由Dr.GeorgeChurch和他的研究小组发明，该系统使用了美国最先进试剂处理和检测的部件，采用了最敏感的检测设备，现在已发展成为一个包含多个基因组学应用领域的研究平台，并且承担了美国“PersonalGenomeProject”的个人基因组测序任务。PolonatorG.007最大的优势在于开机运行成本低和Linux开放资源软件。,PolonatorG.007Workflow,配对末端文库制备：配对末端文库是将基因组DNA打断后，与中间接头连接，再环化，然后用Mme1酶切，使中间接头两端各有30bp的碱基，再加上两端的接头，形成文库。乳液PCR：在微反应器中加入测序模板、PCR反应元件、微珠和引物，进行乳液PCR（EmulsionPCR）。微球富集和固定：PCR完成之后，变性模板，富集带有延伸模板的微珠，去除多余的微珠。将微珠沉积在一块玻片上，微珠上的模板经过3修饰，可以与玻片共价结合。连接反应测序：polonator连接反应的底物是9碱基单链荧光探针混合物。探针的5末端分别标记了CY5、TexasRed、CY3、6-FAM这4种颜色的荧光染料。连接反应中，这些探针按照碱基互补规则与单链DNA模板链配对，结合的探针就提供了一个荧光检测信号，最终被仪器识别。,PolonatorG.007,数据量每次运行可以得到10Gb的高质量数据运行时间80小时读长30bp2，每次运行可以读取1.21.3109个磁珠准确性超过99%运行成本仅为目前二代测序系统运行成本的60%样品数/运行同时支持28道最多16个样品测序,Illumina/Solexa-GenomeAnalyzer,IlluminaGenomeAnalyzer是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，它基于专有的可逆终止化学反应原理。,Illumina/SolexaWorkflow,SolexaGenomeAnalyzer,测序通量高：每次运行后可获得30GB的高品质过滤数据；简单、快速、自动化：制备样品文库可以在几小时内完成，一个星期内就能得到高精确度的数据；DNA序列的读取长度不断增加，当前达到100bp；单个或配对末端支持：GenomeAnalyzer系统支持单个片段或配对末端文库；每张芯片有8个通道，每个通道可单独测序一个样品，也可以把多个样品混合在一起测序。,ABISOLiDLibraryPrep,Shearedfragmentsaretaggedwithadapters(A1andA2)toeachend,ABISOLiDEmulsionPCR,EmulsionPCRperformedusingDNAfragmentsfromlibraryonbeads(m)coatdwithoneoftheprimers,ABISOLiDBeadDeposition,AmplifiedbeadenrichedonpolystyrenebeadscoatedwithA2adaptor;anybeadcontainingtheextendedproductswillbindpolystyrenebeadthroughitsP2end.ThisincreasethethroughputofbeadswithtargetedDNAfrom30%to80%3endofenrichedproductmodifiedtoallowcovalentattachementtoglassslidesurfacerandomly,FluorescentProbes,ABISOLiDSequencebyLigation,Usedualbaseencodingthrough8-merprobeswithaligationsiteatthe3end,afluorescentdyeatthe5end,andacleavagesitebetweenthefifthandsixthnucleotideEachcolorrepresentstwonucleotidesinwhichthesecondbaseofeachdinucleotideunitconstitutesthefirstbaseofthefollowingdinucleotide,knowingjustonebaseinthesequencewillleadustointerpretthewholesequence,Next-GenResearchApplications,denovo测序全基因组重测序/基因组结构变异转录组测序/外显子测序小分子RNA测序分析宏基因组学（Meta-Genomics）泛基因组学（Pangenome）DNA甲基化分析ChIP测序,35,Genomesequencingprojectsstatistics,Next-GenResearchApplications,denovo测序全基因组重测序/基因组结构变异转录组测序/外显子测序小分子RNA测序分析宏基因组学（Meta-Genomics）泛基因组学（Pangenome）DNA甲基化分析ChIP测序,人类基因组计划,HumanGenomeProject,1000GenomesProject,PersonalGenomeProject,CancerGenomeProject,Next-GenResearchApplications,denovo测序全基因组重测序/基因组结构变异转录组测序/外显子测序小分子RNA测序分析宏基因组学（Meta-Genomics）泛基因组学（Pangenome）DNA甲基化分析ChIP测序,转录组测序/外显子测序,转录本结构研究：UTR鉴定、Intron边界鉴定、可变剪切研究等。非编码区域功能研究：non-codingRNA研究、microRNA前体研究等。基因转录水平研究全新转录区域研究,千种植物转录组研究计划,Next-GenResearchApplications,denovo测序全基因组重测序/基因组结构变异转录组测序/外显子测序小分子RNA测序分析宏基因组学（Meta-Genomics）泛基因组学（Pangenome）DNA甲基化分析ChIP测序,小分子RNA测序分析,新miRNA分子的挖掘，其作用靶基因的预测和鉴定样品间差异表达分析miRNAs聚类和表达谱分析等,SmallRNA（microRNAs、siRNAs和piRNAs）是生命活动重要的调控因子，在基因表达调控、生物个体发育、代谢及疾病的发生等生理过程中起着重要的作用。,Next-GenResearchApplications,denovo测序全基因组重测序/基因组结构变异转录组测序/外显子测序小分子RNA测序分析宏基因组学（Meta-Genomics）泛基因组学（Pangenome）DNA甲基化分析ChIP测序,Metagenomics,宏基因组学（也称元基因组学、环境基因组学、生态基因组学）是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以测序分析和功能基因筛选为研究手段，研究微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间关系的新方法。对特定环境微生物种群全基因组DNA研究，可以从整体上对样品群落进行分析，不受微生物是否能培养的限制，而且研究对象从单一基因组到一个基因组集合，也摆脱了对于传统基因组研究的物种限制，开辟了微生物群体基因组学研究的新路径。,Next-GenResearchApplications,denovo测序全基因组重测序/基因组结构变异转录组测序/外显子测序小分子RNA测序分析宏基因组学（Meta-Genomics）泛基因组学（Pangenome）DNA甲基化分析ChIP测序,Pangenome,Pangenome(whole,supra-genome)isthetotalgenerepertoireinagivenspecies,including:coregenome,whichissharedbyallindividuals,dispensa