临床常见标本的微生物检验.ppt

,临床常见标本的微生物学检验,主要内容,1.临床常见标本的微生物检验一、血、骨髓、静脉导管标本二、痰及下呼吸道标本三、尿液标本四、大便标本五、生殖道系统标本六、化脓和创伤标本七、穿刺液标本八、眼、耳、鼻、咽拭子标本九、组织标本,一、血、骨髓、静脉导管标本,（一）血培养检测采血指征临床上疑为败血症、脓毒血症或其他血液感染的患者1.发热（38）或低温（36）2.寒战3.白细胞增多（10109/L，特别有“核左移”未成熟的或杆状核白细胞增多）4.粒细胞减少（成熟的多核白细胞104CFU/ml时有临床诊断意义。（不是绝对的，受多因素影响，综合判断）2.尿液标本的采集和培养中的问题是污染杂菌，故应严格进行无菌操作。3.尿标本采集后应立即送检，以免污染，尿液中不得加防腐剂和消毒剂。,4.除非是流行病学调查，长期留置导尿管患者常规尿培养没有临床意义，大量病原菌常可在这类患者中检出，导尿管留置时间延长易导致与引起患者尿道感染不一致的微生物定植生长；5.不可从集尿袋的下端管口留取标本，集尿袋内的尿液也不能用于培养，可能会引起污染；6.临床常让患者留取清洁中段尿，应该在医护人员监督指导下让患者正确的留取清洁中段尿；7.由于种种原因，患者常常不能正确地留取清洁中段尿，实验室只是针对尿液标本培养的结果进行评估，或常常由于分析前尿液标本污染了多种细菌无法正确解释的结果，可能延误了临床的正确诊断和治疗。,下列因素可使尿液中细菌数量减少，判断结果时应注意,使用抗生素治疗，细菌生长受到抑制；尿液稀释，尿比重1.003，营养成分减少，细菌生长迟缓；尿PH5.0或8.5，细菌生长受阻；尿频时，膀胱内细菌停留时间短，菌落数减少；尿道口消毒液混入标本中，影响细菌繁殖，菌落数减少；不同种类的细菌生长速度不同、营养要求不同，菌落计数有所不同。,接种方式,接种于血平板；置于35普通温箱；18-24小时后观察。采用1ul或者10ul定量接种环。,尿培养的划线方式,1ul接种环：菌落数*1000/ml10ul接种环：菌落数*100/ml5ul接种环：菌落计数*200/ml,尿培养结果评价,正常情况下从肾脏排泌至膀胱的尿液是无菌的，但膀胱中的尿液经尿道排出体外时可受到下尿道中正常菌群的污染而出现细菌。因此对不同方法获取的尿液标本培养结果需正确评价，才能有效指导临床合理治疗。一般认为，清洁中段尿标本中单种细菌菌落数105CFU/ml可能为感染；5104CFU/ml可能为污染，在两者之间需要根据具体情况进行评估（表1）。,表1不同方法采集的尿标本培养结果评价,标本来源菌落数CFU/ml结果评价,清洁中段尿,5104,无意义，仅报告菌落数及革兰染色特征，并注明是纯培养或是混合菌生长,纯培养有意义，报告菌落计数和菌种鉴定及药敏试验结果；混合菌生长无意义，仅做革兰染色镜检，并报告镜检结果,(510)104,纯培养或混合菌生长，其中某种细菌数105者有意义，需进行细菌鉴定及药敏试验；4种及以上细菌生长无意义，报告标本污染,105,3种以内细菌生长都有意义，对2种主要生长菌需进行菌种鉴定及药敏试验；4种及以上细菌生长无意义，报告标本污染,103,导尿,都有意义，所有细菌均需做菌种鉴定及药敏试验,任意数目,耻骨上膀胱穿刺,阴性培养结果报告,培养48h无菌落生长，即为阴性。接种1ul尿量者，应报告“培养48h，菌落计数103CFU/ml”；接种10ul尿量者，应报告“培养48h，菌落计数102CFU/ml”。,阳性培养结果报告,应报告细菌种属名称、菌落计数和药物敏感性试验结果。如：大肠埃希菌生长，菌落计数105CFU/ml，药物敏感性试验结果：,菌落计数105CFU/ml只是诊断尿路感染的一般标准。对一个实验室而言，如果仅使用一个标准对实验结果进行解释，那么若标准制定过松，将会造成抗生素滥用和不必要的资源浪费；制定过严，将有可能导致尿路感染的漏诊。所以每个实验室应在与临床医生密切合作的基础上，根据不同的情况制定不同的解释标准。尿培养菌落计数可受多种因素的影响，在一些患者即使菌落计数较少，也有明显的临床意义，所以对菌落计数5104CFU/ml，“规范”中认为无意义的阳性结果，不应随意丢弃，必要时应根据患者的具体情况或与临床医生联系后，决定是否需要做细菌鉴定和药敏试验。,四、大便培养标本,最常见于感染性腹泻：1.吸收不良性腹泻；轮状病毒、腺病毒、隐孢子虫、致病性大肠埃希菌.2.分泌性腹泻（肠毒素性腹泻）；霍乱弧菌、产肠毒素大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌.3.侵袭性腹泻（渗出性腹泻）；沙门菌属、耶尔森菌、溶组织内阿米巴、侵袭性大肠埃希菌4.抗生素相关性腹泻,（一）采集时间腹泻患者应在急性期，并尽可能在使用抗生素之前采集新鲜粪便；伤寒患者在发病2周以后。（二）采集方法1自然排便采集法自然排便后，挑取有脓血或黏液部位的粪便2-3g，液状粪便取絮状物盛于无菌的容器内或置于保存液或增菌液中送检。2直肠拭子采集法对不易获得粪便或排便困难的患者及婴幼儿，可采用直肠拭子法采集标本，其方法是将拭子前端用甘油湿润。然后插入肛门约45cm（幼儿约23cm）处，轻轻在直肠内旋转，擦取直肠表面粘液后取出，盛入无菌试管或保存液中送检。,（三）实验室检查肠道细菌大多为革兰阴性杆菌，且因粪便标本中有各种正常菌群，形态上区分困难，因此一般不做直接涂片检查。只有当临床怀疑肠道菌群失调或检查霍乱弧菌、结核分枝杆菌、疑似葡萄球菌或难辩梭菌引起的伪膜性肠炎以及真菌性腹泻时，才做直接涂片检查。疑似葡萄球菌引起的抗菌素相关性肠炎，可取水样便或肠黏膜样物涂片，革兰染色后镜检，见革兰阴性杆菌明显减少，革兰阳性球菌大量散在或成堆（葡萄状）排列，可提示肠道菌群失调。,（四）注意事项,在腹泻发病的正确时间收集标本，病人应尽量在急性期（3d）内和用药前采集标本，以提高检出率。大便标本中含有很多杂菌，粪便标本的采集须注意防止外界脏物污染，尽量采用无菌容器。为提高阳性检出率，要采集新鲜标本，立即送检。,标本接种,一细菌性痢疾、伤寒感染（沙门、志贺）取标本接种于SS琼脂平板或麦康凯平板或XLD平板，置于35普通温箱，18-24小时后观察。二伪膜性肠炎（难辨梭状芽孢杆菌）接种于CCFA平板和厌氧血琼脂平板，置于37普通温箱，48小时后观察。三霍乱感染标本接种于碱性蛋白胨水，35培养6-8h后转种于庆大霉素琼脂平板或SS琼脂平板，35普通温箱，18-24小时后观察。四其他感染真菌、小肠结肠炎耶尔森菌、空肠弯曲菌。,接种方式,四区划线，每区均换环。,五、生殖道标本,（一）送检指征1.男性泌尿系统表现尿急、尿频、尿痛尿道分泌物增多会阴部疼痛及阴囊疼痛性功能障碍泌尿生殖器畸形和缺损,2.女性泌尿系统表现分泌物增多及性状异常尿道口搔痒及脓性分泌物流畅下腹疼痛月经失调阴道出血外阴搔痒外阴或阴道疼痛性功能障碍,（二）标本采集生殖器官标本包括子宫颈、阴道、前列腺；男性及女性外生殖器的分泌物及经血等。应根据感染的部位和可能的病原体决定用于病原学诊断的标本种类、采集部位和采集方法等。阴道、子宫颈及前列腺等分泌物应由医师采集，收集于无菌试管内送检。,尿道分泌物1.女性尿道：患者排尿1小时后采集，首先拭去尿道口的渗出物；再用拭子通过阴道，靠着耻骨联合，按摩尿道，采集分泌物；如未获得分泌物，清洗外尿道，用灭菌纱布或棉球擦拭，用泌尿生殖道拭子插入尿道24cm，旋转拭子2秒。2.男性尿道：用泌尿生殖道拭子插入尿道腔24cm，旋转拭子，至少停留20秒，而使之容易吸收。,阴道分泌物擦除过多的分泌物和排出液，用无菌棉拭子采取阴道口内4厘米内侧壁或后穹窿处分泌物，如果需要涂片，需再用一个拭子。男性前列腺：用前列腺按摩法采集前列腺液。清洗尿道口，冲洗尿道膀胱，从肛门用手指按摩前列腺，使前列腺液溢出，用无菌容器收集。无肉眼可见脓液时，可用灭菌拭子轻轻伸入前尿道内，旋转拭子采集标本。,（三）注意事项1.生殖器是开放性器官，标本采集过程中应严格遵循无菌操作规程以减少杂菌污染。2.由于阴道正常菌群的存在而使细菌的分离鉴定受到干扰，所以在采集女性生殖道标本时应注意尽量减少或避免正常菌群的污染。3.疑有宫腔感染，如遇产妇需行剖宫产，待胎儿娩出后取宫腔分泌物，并同时取婴儿耳拭子一同送检。4.沙眼衣原体和病毒均在宿主细胞内繁殖，取材时拭子应在病变部位（移行上皮处稍内）停留十几秒钟，并采集尽可能多的上皮细胞。,5.生殖道感染厌氧菌也较多见，疑有厌氧菌感染时，标本采集和运送应避免与氧气接触，最佳方法是床边采样，直接接种至厌氧装置内。6.淋病奈瑟菌检查时，取材的深度一定要够，因为淋球菌好发于柱状上皮细胞而不是复层鳞状上皮细胞。不论男女尿道及子宫颈均需用拭子插入尿道及子宫颈3cm深转动并停留10-30s取样送检。7.淋病奈瑟菌抵抗力低，对外环境变化颇为敏感，对寒冷和干燥抵抗力很弱。因此，为了保证培养有足够的成功率，取材后要尽快送检，立即接种，标本离体时间越短越好。,直接接种于巧克力培养基，置于5%CO2温箱内，18-24小时后观察。,六、化脓和创伤标本,组织或器官的化脓性感染，其病原菌的来源可分为两类：内源性：感染源是炎症局部周围器官中的正常菌群，由于损伤等因素进入无菌状态的组织内，发生感染。外源性：感染源是存在于人体外部自然界的微生物，由于外伤和直接接触通过人体表面进入人体，造成感染。脓液的细菌学检查对于确定感染的种类（结核性或非结核性等）、提供药物敏感结果和指导临床治疗有重要的意义。,（一）标本采集1开放性感染和已溃破的化脓灶标本采集前先用灭菌生理盐水拭去表面渗出物，尽可能用抽吸或将拭子深入伤口，紧贴伤口前沿取样，从脓肿底部或脓肿壁取样，效果最好。慢性感染，污染严重，很难分离到致病菌，可取感染部位下的组织，研磨成组织匀浆接种于适宜的培养基。2封闭性脓肿局部消毒后用针及注射器抽吸脓肿壁，将所有物质置于无菌试管内送检，疑为厌氧菌感染时立即作床边接种或置于厌氧转运装置送检（针头插一橡皮塞隔绝空气）。但取样时，可能会带入与感染过程无关的定植细菌。3大面积创伤感染：可取感染组织块或沾有脓汁的内层敷料送检。,（二）注意事项细菌对干燥敏感或只能采集少量标本时，用棉拭子采集标本后立即放入液体培养基内，或采标本前先将棉拭子沾少许肉汤以保持标本湿度。对于不能立即送检的标本，应放4保存，培养淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌的标本除外。尽可能在用药前采集标本。采样前病灶局部应避免用抗菌药物或消毒剂。革兰染色对标本进行评估。涂片中如出现上皮细胞提示标本已被污染。没有上皮细胞而有白细胞说明标本采集正确。有的创伤均可有细菌污染，但不一定发生感染，因此对分离到的细菌要根据创伤的情况、菌量和种数，收集标本的处理过程、机体免疫力及抗生素的使用情况等多种因素来分析判断。,标本处理,直接涂片，做出初步判断；接种于血平板，置于35普通温箱；18-24小时后观察。,七、穿刺液标本,穿刺液主要包括:脑脊液胆汁胸水腹水心包液关节液鞘膜液在正常人体中，上述体液均是无菌的。有感染的情况下检出的细菌，在排除污染后应视为病原菌，及时给予正确的治疗，使病人早日恢复健康。,送检指征,脑脊液：症状指征：发热等感染性全身症状、颅内压升高、脑膜刺激症状、神经麻痹症状、脑脊液常规及生化变化；怀疑脑膜炎时。胸水：多伴有胸痛、发热、胸腔积液；疑似胸膜炎、胸腔积水；腹水：有积液伴腹痛、呕吐、肌紧张、肠鸣音弱或消失等。疑似原发或继发性腹膜炎；胆汁：腹痛、黄疸、右上腹压痛、肌紧张、胆囊区深吸气时有触痛；疑似胆石症、胆囊炎、肝胆系统感染等。心包液：发冷、发热、心悸、出汗、乏力及精神症状；心前区疼痛、心包摩擦音、心音明显减弱、心电图改变等。疑似心包炎；5关节液：关节肿胀，关节周围肌肉发生保护性痉挛；疑似化脓性关节炎。,（一）脑脊液1.采集时间：怀疑为脑膜炎的病人，应立即采集脑脊液，最好在使用抗菌药物以前采集标本。2.采集方法：用腰穿方法采集脑脊液35ml，分装到3个无菌试管中，每个试管12ml。第一管用于细菌培养!也可将抽取液直接注入血培养瓶,用血培养仪培养。,3.标本运送和保存：脑膜炎奈瑟菌离体后会迅速自溶,肺炎链球菌和流感嗜血杆菌也很容易死亡,因此,标本应立即送检,并注意保温、防干燥。切不可置冰箱保存,否则会影响检出率。脑脊液标本送检的理想时间为15分钟内，半小时送检是可接受的，如果送检时间超过1小时，则会影响结果。如不能及时送检，可使用血培养瓶（怀疑脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌感染时，请勿使用血培养瓶）,（二）胆汁及其它穿刺液（胸水、腹水、心包液、关节液及鞘膜液等）1.采集时间怀疑感染存在，应尽早采集标本，一般在患者使用抗菌药物之前或停止用药后2-3天采集。2.采集方法无菌操作穿刺抽取标本或外科手术采集标本。标本采集量应1ml;胸腔积液、腹水可抽取10ml;心包液、关节液等可抽取25ml。标本采集后注入无菌小瓶或无菌试管中送检也可将抽取液直接注入血培养瓶，用血培养仪培养。为防止穿刺液的凝固，应在无菌试管中预先加入灭菌肝素，再注入穿刺液。,标本处理,脑脊液：1.若脑脊液标本明显红色或浑浊，直接接种；若脑脊液清晰透明，应以3000r/min离心10-15分钟后，取沉淀物进行接种。2.一般选择血琼脂平皿、巧克力平皿、麦康凯或中国蓝平皿、沙保罗平皿、硫羟乙酸盐肉汤。3.接种前将平板置于温箱中预温30min，保存平皿表面干燥。4.采用10ul定量环接种进行4区划线。接种后37、5%CO2温箱培养24h，若不见生长，继续培养。,注意：1.脑脊液标本不推荐接种与增菌肉汤，其营养条件较弱，不易苛养菌生长：2.脑脊液标本不能使用血培养瓶培养，由于培养瓶中含有的聚茴香胺硫酸钠（SPS）对脑膜炎奈瑟菌有毒性。,胸腹水、胆汁、心包液、关节液等标本的接种,标本处理：将标本取10ul直接接种于血琼脂平皿、巧克力平皿、麦康凯或中国蓝平皿、沙保罗平皿上，除巧克力平皿放入37、5%CO2温箱外，其余平板均放入35普通温箱。备注：由于该方法检出率低，目前国内使用新的接种方法：无菌操作将标本与肉汤按11-12比例加入到已配置的血液增菌肉汤管中，轻轻摇匀。置于35普通温箱，24h后转种到血琼脂平皿上，再次培养24h观察。,八、眼、耳、鼻、咽拭子标本,正常眼部、中耳及鼻窦内是无菌的，而咽峡部有口腔的常在菌丛。耳、鼻、咽部的细菌感染病原菌多源于口腔，口腔中既有需氧菌也有厌氧菌，所以，其周围组织器官的感染不仅考虑是需氧菌，也须检查厌氧菌。,（一）标本采集1.眼结膜：分别用（无菌盐水预湿）拭子绕每一个结膜取；采集完即接种培养基；将拭子涂片在两个玻片上染色。角膜刮擦：滴两滴局部麻醉液；用无菌铲刮擦脓肿或溃疡，将刮擦物直接接种于培养基；将剩余材料涂于两个干净的玻片上染色。液体或抽吸物：备眼，用针头抽吸液体。先用无菌生理盐水冲洗眼部，然后用棉拭子拭干，再用无菌棉拭子采集分泌物。,2.耳内耳：对复杂的、反复的或慢性顽固的中耳炎做鼓膜穿刺术，接触耳鼓室先用肥皂水清洗耳道再用注射器收集液体；对破裂的鼓室，借助耳科诊视器，用软杆拭子收集液体。外耳：用湿拭子将耳道的任何碎屑或痂皮拭去；在外耳道用力旋转拭子取样。3鼻或鼻咽分泌物直接用拭子涂抹病灶部位，切勿接触周围粘膜或皮肤，标本立即送检。4咽分泌物先用清水漱口，用压舌板将舌向下向外压，将咽拭子在咽后壁或悬雍垂后侧涂抹数次，插入运送培养基。切勿接触口腔和舌粘膜。,（二）标本运送和保存标本采集时，无菌手续以稍蘸肉汤的拭子采集病变明显处的脓液和分泌物。采取后拭子应置于运送培养基或培养拭子运送，以防干燥。立即送检，如不能及时送检，应置于冰箱保存，超过48h不可使用。,（三）标本的接种,一.直接涂片：取拭子制成2张涂片，1张行革兰染色，1张行美蓝或异染颗粒染色。做初步报告，便于选择培养基。二.接种于培养基：一般细菌接种于血平皿、巧克力平皿、中国蓝或麦康凯上，置于35