免疫实验加样枪的使用

实验一练习加样抢的使用,1.练习加样抢的使用：重复性操作实验：（加低浓度的重铬酸钾黄色液体），每孔100ul。加32孔，每位同学需要一块空板加样，450nm比色后计算各自的cv值.,2.加样枪的使用与维护,加样枪的使用1、量程的调节2、枪头（吸液嘴）的装配3、移液的方法加样枪的维护保养使用的注意事项,加样枪的使用,量程的调节转动加样枪顶部的按钮进行移液量的设定。在调节量程时，如果要从大体积调为小体积，则按照正常的调节方法，逆时针旋转旋钮即可；但如果要从小体积调为大体积时，则可先顺时针旋转刻度旋钮至超过量程的刻度，再回调至设定体积，这样可以保证量取的最高精确度。（在该过程中，千万不要将按钮旋出量程，否则会卡住内部机械装置而损坏了移液枪。）,枪头（吸液嘴）的装配在将枪头套上移液枪时，很多人会使劲地在枪头盒子上敲几下，这是错误的做法，因为这样会导致移液枪的内部配件（如弹簧）因敲击产生的瞬时撞击力而变得松散，甚至会导致刻度调节旋钮卡住。正确的方法是将移液枪（器）垂直插入枪头中，稍微用力左右微微转动即可使其紧密结合。如果是多道（如8道或12道）移液枪，则可以将移液枪的第一道对准第一个枪头，然后倾斜地插入，往前后方向摇动即可卡紧。枪头卡紧的标志是略为超过O型环，并可以看到连接部分形成清晰的密封圈。,移液的方法移液之前，要保证移液器、枪头和液体处于相同温度。吸取液体时，移液器保持竖直状态，将枪头插入液面下1厘米。在吸液之前，可以先吸放几次液体以润湿吸液嘴尤其是要吸取粘稠或密度与水不同的液体时。注意吸液体时，一定要缓慢平稳的松开拇指，绝不允许突然松开，以防将溶液吸入过快而冲入移液器内腐蚀柱塞而造成漏气。,前进移液法用大拇指将按钮按下至第一停点。将吸头插入液面下1厘米深处并慢慢松开按钮回原点，待管嘴吸入溶液后，将管嘴撤出液面并斜贴在试剂瓶壁上淌走多余的液体。将加样枪移至待加入液体的容器，让吸头位于容器液面的近上方。轻轻压上按钮至第一停点排出液体，待一秒钟后继续按按钮至第二停点吹出残余的液体，并让吸头尖部轻轻接触液面上方的容器壁，以免产生气泡。继续按住按钮，撤出加样枪后松开按钮使之返回按钮起点位置。,反向移液法（略）此法一般用于转移高粘液体、生物活性液体、易起泡液体或极微量的液体，其原理就是先吸入多于设置量程的液体，转移液体的时候不用吹出残余的液体。先按下按钮至第二停点位置将吸头插入液面下23毫米深处并慢慢松开按钮至原点。待管嘴吸入溶液后，将管嘴撤出液面并斜贴在试剂瓶壁上淌走多余的液体。将加样枪移至待加入液体的容器，让吸头位于容器液面的近上方。轻压下按钮按至第一停点排出液体。继续保持按住按钮位于第一停点（千万别再往下按），取下有残留液体的枪头，弃之。,重复操作移液法（略）,适用于快速、简便地重复转移等量的同种液体。先按下按钮至第二停点位置将吸头插入液面下1厘米深处并慢慢松开按钮回原点，待管嘴吸入溶液后，将管嘴撤出液面并斜贴在试剂瓶壁上淌走多余的液体。将加样枪移至待加入液体的容器，让吸头位于容器液面的近上方。轻压下按钮按至第一停点排出液体。继续保持按住按钮位于第一停点（千万别再往下按），重复步骤b和c，就可多次复重移取等体积的同种液体。,全血移取法（略）,采用前进法步骤a和步骤b使吸头吸满血液，用干净的干燥薄棉纸小心将吸头外的血液擦干净。将吸头浸入液面下，然后将按钮压至第一停点位置，操作时务必确保吸头始终于液面之下。慢慢松开按钮让按钮回到起点位置，使吸头内吸入试剂，再按下按钮至第一停点位置，然后慢慢松开按钮。重复此项操作直至待转移的液体（如全血）全部转移至溶液中。最后，再按下按钮至第二停点位置，将吸头内的液体（全血）彻底放干净即可。操作时应注意使吸头始终位于液面之下。,加样枪的维护保养,如不使用，要把移液枪的量程调至最大值的刻度，使弹簧处于松弛状态以保护弹簧。并将其竖直挂在移液枪架上，每天使用完后，应对加样枪外表面进行清洁，特别需要注意加样枪嘴锥处，不能残留溶液（血液）。用10%的次氯酸钠溶液或70%的酒精溶液清洁后，自然晾干。微量加样枪必须按要求定期进行校准。（低于10ul的移液器每半年送华南计量研究所进行校准。其它型号的移液器每半年校准一次，由被授权的人员完成。）,使用的注意事项,设定加样体积，不能大于加样枪标定的移液范围加样吸头的装配（前面已提到）每次吸样应更换加样吸头，防止交叉污染。加样前，一定要检查吸头是否上紧，以免液体漏出或取液不准。方法是吸取液体后悬空垂直放置几秒中，看看液面是否下降。要保证在整个吸液过程中，吸头尖端要一直处于液面之下，即防止吸空造成吸样不准确。,吸取液体完成后排出液体之前，一定要擦去吸头四周的液体，特别是在取液量较少时尤其要注意这一点。但要防止接触吸头尖端。吸取液体和排出液体动作都一定要慢，因为动作过快，液体因表面张力吸附在吸头壁上，造成移液不准。所取液体的粘度越高，越应该注意这个问题。排出液体时，在液体将排尽时，要轻轻让吸头尖端接触容器壁，以免在加样的容器中形成气泡，影响后续反应。,加样完成后，应在弃去使用过的吸头后，方才松开按钮至起始位置，以免吸头内的残留液体回吸到枪头，造成交叉污染。当移液器枪头里有液体时，切勿将移液器水平放置或倒置，以免液体倒流腐蚀活塞弹簧。吸取液体时，一定要缓慢平稳的松开拇指，绝不允许突然松开，以防将溶液吸入过快而冲入移液器内腐蚀柱塞而造成漏气。,加样枪严禁吸取有强挥发性、强腐蚀性的液体（如浓酸、浓碱、有机物等）不要用大量程的加样枪移取小体积的液体，以免影响准确度。所使用的加样枪应在校正期限内。,谢谢大家！,实验二练习加样抢的使用,1.计算每位同学倍比稀释的准确性。在酶标板第一孔加重铬酸钾黄色液体200ul,往右4孔每孔加DH2O100ul,从第一孔吸出100ul重铬酸钾黄色液体往右做倍比稀释,共做4行后,450nm比色计算其倍比稀释的cv值.,2.1000倍稀释方法的计算及使用：100ul+900ul稀释10倍10ul+990ul稀释100倍或第一部50倍稀释，第二部20倍稀释？,实验二双向免疫扩散试验说明：可溶性抗原与相应抗体在半固体琼脂介质中相互扩散，相遇后发生特异性结合，出现可见的沉淀线。,在琼脂凝胶中，待检人血清IgG和羊抗人IgG抗血清在不同孔内各自向四周扩散，在比例恰当处形成肉眼可见的白色沉淀线，证明两者发生特异性结合反应。,实验原理,试剂健康人血清，用生理盐水做1:51:40系列倍比稀释、羊抗人IgG抗血清、1015g/L琼脂糖或琼脂粉。仪器水浴箱、温箱。材料载玻片、微量加样器、打孔器、5ml吸管、吸球、湿盒等。,实验器材和材料,制备琼脂凝胶：用生理盐水配置1015g/L琼脂，隔水加热煮沸备用。浇板：将载玻片置于水平台上，用吸管吸取44.5ml融化的琼脂倾注于玻片上，滴加时注意速度不要过快，要使琼脂盖满整张玻片，使其均匀、饱满，勿溢出并避免产生气泡。打孔：待琼脂凝固后，将梅花形打孔模板置于琼脂板下，用直径3mm的打孔器打孔，使其孔径为3mm，孔距为4mm，孔要求圆整光滑，孔缘不能破裂，底部勿与载玻片脱离。加样：用10l微量加样器分别取抗原、抗体加入孔中。中心孔加入抗体，周围孔分别加入不同稀释度的抗原。温育：将加好样的琼脂凝胶板平放于湿盒中，37温箱温育24h，观察沉淀线。,实验方法,操作示意图,1,2,3,4,5,6,以出现沉淀线的正常人血清最高稀释度为人血清IgG的扩散效价。,结果判断,该方法简便易行，结果稳定可靠。根据抗原抗体相遇后所出现沉淀线的特征，对其进行定性分析。若相邻两孔内抗原成分完全相同，则形成完全相连的两条沉淀线；若抗原完全不同，则形成交叉的两条沉淀线；若抗原部分相同，则形成部分相连的两条沉淀线.,实验讨论,实验三对流免疫电泳说明：双向免疫扩散+电泳定向加速,在偏碱性的缓冲液和适当的直流电场中，抗原和抗体的扩散具有一定的特点。在pH8.6以上的缓冲液中，大部分蛋白质抗原解离带负电荷，在电场中向正极泳动；而大部分抗体属于IgG，在此种pH条件下只带微弱的负电荷，由于其分子量大，暴露的极性基团少，在电场中泳动缓慢，且受电渗作用的影响，带正电荷的液体推动抗体分子向负极泳动。由此抗原、抗体就达到了定向对流，在两者相遇且比例合适时便形成肉眼可见的白色沉淀线。,实验原理,实验器材和材料,试剂：人血清、抗人血清、pH8.60.05mol/L巴比妥缓冲液、用巴比妥缓冲液配置1%琼脂。仪器：电泳槽、电泳仪、水浴箱。材料：孔型模板、打孔器、滤纸、纱布条、微量加样器、载玻片、吸管、吸球等。,制备巴比妥琼脂凝胶：取出一清洁载玻片，用75%乙醇冲洗干净，晾干备用。将1%巴比妥琼脂融化后，置56水浴中备用。用吸管吸取44.5ml琼脂溶液滴加于玻片上，室温放置，待凝固后打孔，孔径3mm，孔距10mm。加样：用微量加样器分别吸取抗原10l加入阴极侧孔内，抗体10l加入阳极侧孔内，所加样品切勿外溢。电泳：将加样完毕的琼脂板置电泳槽的支架上，抗原孔置阴极端，抗体孔置阳极端，电泳槽内加pH8.6的0.05mol/L巴比妥缓冲液至电泳槽的三分之二处，琼脂板两端分别用盐桥与缓冲液相连。控制端电压为56V/cm板长，电泳3060min。电泳完毕后，切断电源。,实验方法,操作示意图,在抗原和抗体两孔之间形成的白色沉淀线即为抗原抗体复合物。如果沉淀线不够清晰，于湿盒中37保温数小时，可增强沉淀线的清晰度。,结果判断,此方法简便、快捷。敏感性比双向免疫扩散法高816倍。需要选择高特异性、高亲和力的抗体，否则结果难以判断。,实验讨论,实验一直接凝集实验,直接凝集实验定义：颗粒性抗原与相应抗体直接反应，在适当电解质参与下出现的肉眼可见的凝集现象。常用的试验方法有玻片凝集法和试管凝集法。本实验以试管法凝集试验肥大试验（Widaltest）验证凝集反应及其特点。,Widaltest原理将已知的颗粒性抗原（伤寒沙门菌）定量加入到系列倍比稀释的待测血清中，根据各血清稀释度凝集情况，测定血清中有无相应抗体及其相对含量。,实验器材和材料器材：试管、吸管、恒温水浴箱等试剂：抗体待测伤寒沙门菌免疫血清、抗原伤寒沙门菌诊断菌液（7108/ml)、生理盐水,实验方法（Widaltest）取试管7支，依次编号并做好标记。每支试管中加生理盐水0.5ml。倍比稀释血清：取120稀释的待测血清0.5ml加入到第1管，混匀后吸取0.5ml加入到第2管，如此连续稀释至第6管，混匀后吸取0.5ml弃去；第7管不加血清作为阴性对照。加诊断菌液：每管加伤寒沙门菌H（鞭毛）或O诊断菌液0.5ml，此时各管血清最终稀释度依次为180、1160、1320、1640、11280、12560摇匀后置37水浴24h，取出观察结果或放室温过夜，次日观察结果。,试管凝集法操作程序,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,弃掉0.5,结果,1234567,菌液,试管凝集试验原理,结果判断实验结果将试管置于有良好光源和黑色背景下，观察管底凝集物的范围和上清液的浊度，记录凝集程度，判断凝集效价用+、+、+、+、-等符号记录凝集效价。对照管：应无凝集现象试验管：“+”：上清液澄清，细菌全部凝集，凝集块全部沉于管底“+”：上清液稍混浊，细菌大部分凝集并沉于管底“+”：上清液较混浊，约50%的细菌凝集并沉于管底“+”：上清液混浊，仅少量细菌凝集“-”：不凝集，液体浊度与对照管相同血清抗体效价：试验管出现“+”以上的凝集现象即可判断为阳性；以出现“+”凝集的最高血清稀释度为该待测血清的抗体效价。,注意事项凝集反应只有在抗原抗体比例适当时，才能出现肉眼可见的反应。一般情况下，随着血清浓度的逐渐稀释，凝集反应越来越弱，但在抗体浓度过高时，反而无凝集现象出现，此为前带现象，出现该情况时，须加大抗体稀释倍数重新试验。,在诊断血清中，混悬液由混浊变澄清并出凝集物，则为阳性结果；混悬液仍为匀混浊的乳状液，则为阴性结果。,结果分析,实验讨论1.肥大试验是一种经典的半定量试管凝集试验。在临床上主要用已知的伤寒沙门菌O或H抗原检测血清中有无相应的特异性抗体及其效价，以协助诊断伤寒病或供流行病学调查。2.凝集反应只有在抗原抗体比例适当时，才能出现肉眼可见的凝集现象。,实验五ELISA法：乙肝表面抗体的测定（肝素抗凝管，现场抽血）,1.原理：固相Ag+待测Ab+酶标记Ag固相Ag待测Ab酶标记Ag加底物常用的底物：,四甲基联笨胺（TMB）:稳定性好、试验过程无需避光。经辣根过氧化物酶（HRP）作用后呈蓝色，加硫酸终止后变黄色。在商品ELISA试剂盒中：底物为A和BA：过氧化氢B：四甲基联笨胺,2.检验方法：1）每孔加入待测样本50ul,设阴阳对照各两孔，每孔加入阴阳对照各50ul（或1滴），并设空白对照1孔。2）每孔加入酶结合物50ul（或1滴）,空白对照除外，混匀，封板，37度孵育30分钟。3）手工洗板5次，洗液注满各孔静置5秒。4）每孔加底物各1滴，封板，37度孵育15分钟,5）每孔终止液各1滴，混匀。6）用酶标仪读数，取波长450nm,空白调零，读取各孔OD值。3.参考值：参考值cut-offvalue(cov)=阴性对照平均OD值*2.1阴性对照OD值低于0.05作0.05计算，OD0.05或小于等于0.1的按实际OD计算。4.检验结果的解释：样本的OD值cov,样本HBsAb检测结果为阳性,二、大吞噬实验,实验原理：巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有强大的吞