动物实验技术1课件

1,动物实验的设计与分组,动物的性别鉴定与日龄判断,动物的编号、标记及去毛方法,实验动物的抓取与固定,2,动物的给药途径与方法,动物体液的采集,动物的安乐死,小鼠的解剖,动物的麻醉,1、理论准备主要指了解动物实验的基础理论知识、选题立项和设定假设、研究计划和方案的制订、实验方法的选择、技术参考文献查阅等。2、条件准备指仪器设备的备置与校准、药品的配制、器械的准备、实验动物的购入、实验场所消毒与器具配套等。3、预备实验是正式实验的“预演”。动物实验前的准备工作为完成动物实验提供必备的理论基础、物质条件和试探性摸索，对开展好动物实验研究十分重要。,3,动物实验前的准备工作,购入或领取动物时，应注意以下几个方面问题：购入或领取实验动物前，应进行各项计划的核实，检查各项实验前的准备工作，如动物笼盒数量、饲养室卫生及消毒情况等；购入或领取实验动物时，应向供应部门索取所用动物的遗传背景和微生物质量资料(动物质量合格证)、以及动物品系、年龄、体重、胎次等资料；根据试验观察时间长短的需要，同时购入或领取相应数量的饲料和垫料；若是从外地购入动物需长途运输时，还应考虑到途中各种因素对动物的影响，如运输环境的温度、湿度、饮食（尤其注意途中污染和窒息死亡等问题）；若是购入或领取清洁级以上实验动物，应采用带有空气过滤膜的无菌运输罐或带过滤帽的笼盒运输，严格检查其密封状况。,预备实验,预备实验也称预实验、初试实验，是在动物实验前对正式实验进行初步试验。预备实验是正式实验的“预演”。其目的在于检查各项准备工作是否完善，实验方法和步骤是否切实可行，测试指标是否稳定可靠，初步了解实验结果与预期结果的距离，从而为正式实验提供补充、修正的意见和经验，是动物实验必不可少的重要环节。预备实验可使用少量动物进行，实验方法和观测指标应和正式试验一样。但是，预备实验的结果不能归入正式试验的最后结果中一同分析。,6,抓取和固定是动物实验操作中一项最基本的技术，所有的动物实验都要涉及到。不同种类动物的抓取与固定方法不尽一致，同种动物的抓取与固定方法也可以不同。另外，不同实验者的操作习惯上也存在着差异。无论采用何种抓取固定方法，都应遵守以下基本原则：保证实验人员绝对安全；防止动物意外损伤；禁止粗暴对待动物。,实验动物的抓取与固定,7,由于动物害怕陌生人接触其身体，对于非条件性的各种剌激会进行防御性反抗。因此，在抓取、固定前应对动物的生活习性有所了解，根据其生活习性采用相应的抓取固定方法。一般在抓取固定动物过程中首先慢慢友好地接近动物，并注意观察其反应，让动物有一个适应过程。抓取时力求准确、迅速、熟练，争取在动物感到不安之前，抓取到动物。,8,一、小鼠的抓取与固定,1抓取方法习惯用右手者，首先用右手从笼盒内将小鼠尾中部或基部抓住(不可抓尾尖)，并提起或放在左手上或笼盖上。也可用尖端带有橡皮的镊子夹住小鼠的尾巴。抓取时需注意，如果过分用力，会使动物窒息或颈椎脱臼；用力过小，动物头部能反转来咬伤实验者的手。因此实验者必须反复练习，熟练掌握。,9,二、大鼠的抓取与固定,1抓取方法,方法一：同小鼠偏小的大鼠方法二：偏大的大鼠张开左手虎口，食指和中指挟住左前肢，迅速将拇、中指插入大鼠的腋下，虎口向前，其余三指及掌心握住大鼠身体中段，并将其保持仰卧位，然后调整左手拇指位置，紧抵在下颌骨上（但不可过紧，否则会造成窒息），即可进行实验操作。,如果是第一次抓取大鼠（或者大鼠特别凶猛）时，最好戴防护手套（线手套，帆布或硬皮质均可），但徒手操作时手掌的温暖可使大鼠变得温顺，很快停止抗争，并在以后的操作中更加顺从。抓取大鼠时，应特别注意不能捉提其尾尖，因为尾尖皮肤易于拉脱，也不能让大鼠悬在空中时间过长，否则会激怒大鼠翻转咬人。,10,三、家兔的抓取与固定,1抓取方法,抓取时，轻轻打开兔笼门，不要使兔受惊，然后右手伸入笼内，从兔头前部把两耳轻轻压于手掌内，兔便卧伏不动，此时将颈背部被毛和皮肤一起抓住提起，并用左手托住兔臀部，使其体重主要落在左手上。兔一般不咬人，但爪锐利（戴防护手套），挣扎时极易抓伤操作人员。因此，必须防备其四肢的活动。特别注意不能只提兔双耳或双后腿，也不能仅抓腰或提背部皮毛，以避免造成耳、肾、腰椎的损伤或皮下出血。,11,一、动物实验设计的基本原则实验研究主要是通过对样本的研究而得出结论。要将样本的结论外推到总体，必须尽量使样本能够真实地代表总体。然而，实验动物的种系和个体差异、实验环境的差异、仪器的稳定性、药品的纯度、样本的大小等因素都可能产生实验误差，影响样本结果的代表性。,动物实验的设计与分组,12,13,自体对照,前后对照,左右对照,建立对照组,(antitheses),1.对照性原则（control）,组间对照,14,1.前后对照：是在同一个体身上观察给药前后某种指标的变化，此种对照可减少个体差异，但不能克服随时间而变的素因的影响。如肝炎有自愈倾向，给药后肝功好转不一定是药物的作用，故自身对照实验可能会得出错误结论。除非有可靠证据说明检测指标不随时间而变或同时设组间对照，否则不宜使用自身对照。,1.对照性原则（control）,15,2.组间对照：是实验中设若干平行组，进行各组间比较。这种设计符合平行对照的原则，最为常用。组间对照实验设计：1正常对照组（或阴性对照组，或空白对照组）：正常动物，给药物赋型剂。给药途径同给受试药组。2模型对照组：如制备肝硬化、高血压、心肌梗塞等。不用药物治疗，给赋型剂，给药途径同给受试药组3阳性对照组：制造动物病理模型，给已知药物作对照。,1.对照性原则（control）,16,阳性对照药的选则：应选已批准上市或公认的有效药物作阳性对照药，所选药物尽量是同类药，以便比较作用强度，如抗癌药研究一般选卡铂、顺铂、环磷酰胺等；如抗溃疡药研究一般选法莫替丁。设阳性对照组的目的：考察实验方法的可靠性、稳定性。考察受试药的作用性质、强度，从而发现受试药的优缺点。阳性对照药的剂量选则：如要比较阳性药与受试药的作用强度，应设多个剂量组。如受经费等的限制，也可设一个剂量组，但此时设阳性对照组的作用只是考察方法的可靠性，不能得出受试物作用强弱的结论。阳性对照药的给药途径，如能做到，尽量同受试药组。,1.对照性原则（control）,17,在用动物疾病模型（如高血压）实验时，在动物A的基础上加了处理B高血压，加上溶媒C，故欲判定药物D的作用，给药组的设计必须满足下述设计：模型对照组：A+B+C药物实验组：A+B+C+D,1.对照性原则（control）,18,为了判定实验模型的成功与否，即此指标的变化（血压升高）是否是由于造模的结果还是自发性波动，必须另设空白对照组。故更完整的实验设计应如下：空白对照组：A+C模型对照组：A+B+C阳性对照组：A+B+C+阳性药药物实验组：A+B+C+D,1.对照性原则（control）,19,正常对照并不是不给任何处理的对照，而应施以和受试组相同的操作条件，如动物的质量、饲养条件、药物溶媒、给药途径、给药次数、手术过程。,1.对照性原则（control）,20,为获得可靠的实验结果，最重要的是实验过程中保证试验组与对照组之间除被研究的处理因素不同之外，非处理因素如实验对象、实验条件、实验环境、实验时间、药品、仪器、设备、操作人员等，均应力求一致。,2.一致性原则(consistency),21,动物实验的结果应能稳定地重现出来，重现实验过程称重复。重复有二个含义：一是只做一批实验，在不同个体身上重复，如每一实验组要做多只动物，小鼠和大鼠一般每组要在10只以上，这种重复适合于绝大多数实验。另一种重复的含义是，每次每组做10只小鼠（体内）或4管样品（体外），反复重复3次，这主要是一些特殊实验的要求，如抗肿瘤药的研究。,3.重复性原则(repetition),22,重复时要求每组要有足够的动物数或标本数，重复的主要作用是估计实验误差、降低实验误差和增强代表性，提高实验结果的精确度和真实性。应该在保证实验结果具有一定可靠性的条件下，确定最低的样本例数。,3.重复性原则(repetition),23,不同实验要求的样本数不同，基本规律是实验个体的指标变异愈小，则均数的标准差愈小，所需样本数愈小，反之要增大样本数。一般说来，计量资料从每个个体中获得的信息多，所需样本数小，计数资料对信息浪费大，所需样本多。预试时对照组与实验组有差别，但显著性检验时P0.05，可能系样本数不足所致，正式实验时可增大样本数；如组间确有差异，样本数增大后可达显著性水平；如组间确无差别存在，样本数增大后对照组与实验组在预试时出现的差别就会消失。,3.重复性原则(repetition),24,1）一般估测的样本数小动物(大鼠、小鼠、蛙、鱼)：每组10-30例,计量资料每组不少于10例，计数资料每组不少于30例；中等动物(豚鼠、家兔)每组8-20例，计量资料每组不少于8例，计数资料每组不少于20例；大动物(犬、猫、猪、羊等)每组6-20例，计量资料每组不少于6例，计数资料每组不少于20例。,25,2）按统计学方法测算的样本数n=22(t+t)2/2n为样本含量，为标准差；t取有显著性的t分布值，t0.05=1.96；t为无显著性的t分布值，1-为实验检验能力，动物实验一般取1-=0.80，t0.20=0.842；为处理组与对照组均值间的差异，可从预实验或文献资料库中获得。,26,举例：给某种动物饲喂一种药物，预实验中每月体重增长比对照增加3015g（均值标准差）。设显著水平为95%，检验能力为80%，则正式实验所需样本含量n为：n=2152（1.96+0.842）2/302=3.93即每组只需4只动物。,n=22(t+t)2/2,27,重复实验时要严格控制实验条件，在各次重复中使条件尽量前后一致，严防干扰因素对各批实验的影响。应控制的干扰因素包括：（1）动物：品系、性别、体重、年龄、饲料、饲养环境，（2）药物：批号、剂量、溶解度、稳定性、注射容量、注射速度、酸碱度、温度、保存条件。（3）仪器：灵敏度、精确度、零点飘移、电压稳定性及操作熟练程度。（4）环境：室温、气压、湿度、季节，甚至实验的上午或下午、动物的群养和独养也影响实验结果。,3.重复性原则(repetition),28,随机包括随机分组和随机操作。1随机分组：随机分组就是按照机遇原则来进行抽样或分组，其目的是使一切干扰因素分配到各组时只受纯机遇的抽样误差的影响，由于机遇对每个组来说是相等的，未知因素可对每个组产生影响，使每个组的同一指标平行增加或减少，这就避免了实验者主观因素或其它偏差性误差的影响。如观察药物对大鼠实验性胃溃疡的影响，应先造成大鼠胃溃疡模型，然后将已成型动物随机分配到各组中，从而避免了造型过程中人为因素的影响。,4.随机性原则(random),29,随机化手段可用随机数字表，这在一般统计学书上均可检索到，也可用电脑统计学软件生成。近年来提倡均衡下的随机（随机区组法），即先将能控制的因素（性别、体重、病情严重程度等）均衡地分档，然后在每一档中随机取出等量动物分配到各组，使哪些较难控制因素（如活泼程度、饥饱程度、疲劳程度）得到随机安排。,4.随机性原则(random),30,典型分组举例：某实验者有小鼠60只，各半，体重18-22g,欲分为6组，如何分组？1.分别将鼠分开，各一笼，每笼30只。2将鼠30只按体重分笼，分别为18g,19g,20g,21g,22g，共5笼。每笼有同一体重鼠4-8只。,4.随机性原则(random),31,3按电脑统计软件，生成随机顺序如下：第一批：6，3，2，4，1，5第二批：1，4，5，3，2，6第三批：4，5，2，3，6，1第四批：2，4，5，3，1，6第五批：3，6，1，5，2，4,4.随机性原则(random),32,4.备好6只鼠笼，分别标为A.正常对照组，B.模型对照组，C.阳性对照组，D.某药低剂量组，E.某药中剂量组，F.某药高剂量组。5.从18g笼（如有4只小鼠）开始取小鼠，按第一批随机顺序，依次放入F组、C组、B组、D组。A组和E组各缺1只鼠，从体重最为接近的19g笼中取出，依次放入A组和E组。第二批和第五批随机方法依此类推。6.重复上述过程，将30只鼠随机分入6个实验组中。分组结果，各实验组小鼠同性别鼠数量相等，各组平均体重相近，各组在不同体重档次中的小鼠数相近。各组鼠的营养状态及活泼程度接近。,4.随机性原则(random),33,2随机操作：实验过程如可能受随时间变化而变化的已知和未知因素的影响，则操作过程的顺序（不论是组间或是组内）也应是随机的，不应按一固定顺序进行，否则会出现顺序误差。操作典型错误举例：某实验者进行抗心肌梗塞实验，60只大鼠，分为6组进行冠状动脉结扎，分别分为假手术对照组（只开胸不结扎冠状动脉）10只、模型对照组10只，阳性对照组10只，药物低、中、高剂量组各10只。实验时按组别顺序依次对第1-6组进行手术。,4.随机性原则(random),34,错误：该实验各组手术依次进行，未遵照随机操作的原则，实验结果可能会受随时间变化因素的影响，如受麻醉、动物体内生理状态（如血糖水平）的时晨变化、环境的经时性变化，如室温等。这些因素可能导致顺序误差。体外实验如一次操作时间短（如在一个细胞培养平板上的操作），对指标不发生影响时，可以顺序操作，此时应严格控制实验条件，使其稳定不变，特别是环境变化。样品数不宜过多，以便缩短操作时间。体外实验如在短时间内分批进行（如在几块细胞培养平板上的实验），每批均应同时做对照组，以消除顺序误差。正确的操作顺序：共分10批进行。第1批手术动物，每组各做一只（平行操作），各组顺序随机排列。第2-10批如法进行。,4.随机性原则(random),35,力戒主观偏性干扰，选择观察指标时，不用或尽量少用带主观成分的指标。结果判断要客观，更不能以主观的意愿对数据做任意改动或取舍。,5.客观性原则(objectivity),36,37,单组比较设计是指在同一个体上观察实验处理前后某种观测指标的变化。优点：能排除个体间生物差异。缺点：不适用于在同一个体上多次进行实验和观察的情况。有时生理盐水等阴性对照在前后两次测量时一些指标也出现一定差异(如体重、血压等)。,1.单组比较设计,38,配对比较设计是指实验前将动物按性别、体重或其他有关因素加以配对，以基本相同的两个动物为一对，配成若干对，然后将一对动物随机分配于两组中。在配对比较设计中两组动物的数量、体重、性别等情况基本相同，取得均衡进行实验，以减少误差及动物间的个体差异。优点：减少两组实验误差及动物间的个体差异。缺点：应考虑种属、品系、性别、年龄与体重、同父母、同胎次出生等因素对实验结果的影响。,2.配对比较设计,39,随机区组设计是配对比较设计的扩大。将全部动物按体重、性别及其他条件等分为若干组，每组中动物数目与拟划分的组数相等，体质条件相似，再将每个区组中的每一只动物进行编号，利用随机数字法将其分配到各组。优点：均衡性好，可减少误差，提高实验效率，统计分析也较简易。缺点：抗数据缺失能力较低。若一个区组的某个动物发生意外，那么整个区组都得放弃，或不得已采取缺项估计。,3.随机区组设计,40,举例：分配5个区组的15只BALB/c小鼠接受甲、乙、丙三种抗癌药物的疗效分析，如何进行设计？,先将小鼠按体重大小编号，体重相近的3只小鼠配成一个区组；在随机数字表上选取随机数字，依次排列；在每个区组内将随机数字按大小排序，各区组内序号为1的接受甲药，序号为2的接受乙药，序号为3的接受丙药。,41,完全随机设计是将每个实验对象随机分配在各组，并从各组实验结果的比较中得出结论。通常用随机数字表法进行完全随机化分组。优点：设计和统计分析都较简单，抗数据缺失能力较强。缺点：但在样本数较少时往往不能保证组间的一致性。对非实验因素缺乏有效控制，适用于实验对象同质性较好的实验设计。,4.完全随机设计,42,完全随机设计只涉及到一个处理因素。随机区组设计涉及到一个处理因素，一个区组因素。倘若试验研究涉及一个处理因素和两个控制因素，且每个因素的类别数或水平数相等，此时可采用拉丁方设计来安排实验。将两个控制因素分别安排在拉丁方设计的行和列上。在同一横行与同一纵列中都没有重复的字母，可进行不同横行与不同纵行之间的对调，任意选择一种排列方式。,5.拉丁方设计,43,例：比较A、B、C、D四种药物给家兔注射后产生皮肤疱疹大小时，考虑到四个注射部位的影响因素，如何进行拉丁方设计？,可选用甲、乙、丙、丁四只家兔，并选择不同的四个部位（1、2、3、4）进行注射。拉丁字母代表四种不同的药物，行区组代表家兔，列区组代表注射部位。123412341234甲ABCD1CDAB1CBAD乙BCDA2BCDA2BADC丙CDAB3ABCD3ADCB丁DABC4DABC4DCBA1,3两行对调2,4两列对调,44,正交设计是研究多因素试验的一种设计方法。其特点是利用一套规格化的表格正交表来安排试验，适用于多因素、多水平、试验误差大、周期长等一类试验的设计。在实验设计过程中只要根据试验条件直接套用正交表即可，而不需要另行编制。正交表在统计学书上都可查。常用的正交表中，适用于二水平试验的有L4(23)、L8(27)；适用于三水平试验的有L9(34)、与L27(313)等，还有适用于四水平、五水平及水平数不等的各种正交表。选择哪一种正交表要根据试验的具体条件来决定。,6.正交设计,45,仅以L9(34)为例，说明其意义及使用方法。L代表正交表，右下角9字表示这张表需安排9次试验。括号内3，表示这张表适用于三水平的试验，3的右上方指数4，表示最多可以安排4个因素的试验。(34)表示全面试验所作的试验次数。总的来说，L9(34)的意思是用这张表进行试验设计，最多可以安排4个因素，每个因素取三个水平，一共进行9次试验。,46,动物随机分组的方法很多，最常用最好的方法是使用随机数字表或计算器。随机数字表上所有数字是按随机抽样原理编制的，表中任何一个数字出现在任何一个地方都是完全随机的。计算器内随机数字键所显示的随机数也是根据同样原理贮入的。随机数字表使用简单。假设从某群体中要抽10个个体作为样本，那么，可以先闭目用铅笔在随机数字表上定一点。假定落在第X行Y列的数字76上，那么可以向上(向下，向左，向右均可)，依次找9个数字，把包括76在内的这10个号的作为样本的代号，来作为研究总体的依据。使用计算器产生随机数时，每当按下2ndF(第二功能键)和RND(随机数字键)时，随机数就产生。产生的随机数值是0.000至0.999，把前两个小数位用作一个样本个体。如输入2ndFRND显示为0.166，表明第十六个数据作为一个样本个体，重复按键操作，直到产生所需的样本大小，由于随机数是随机产生的，所以，绝对不会产生相同的数目。,动物随机分组方法,47,例：设有雄性Wistar大鼠12只，试用完全随机的方法，分为甲、乙两组。,分为两组,分组方法：将12只大鼠按体重大小进行编号。在随机数字表上取随机数字：假设所产生的点是随机数字表上第X行第Y列的78，则从78开始，由上向下抄12个随机数字，如下：动物编号123456789101112随机数字78386957910374566826541,组别乙乙甲甲甲乙甲甲乙乙甲甲,现在以随机数字的奇数代表甲组，偶数代表乙组，则编号为3、4、5、7、8、11、12号分入甲组，而1、2、6、9、10号分入乙组。,组别鼠的编号甲组3457812乙组12691011,因两组数字不等，继续用随机方法将甲组多余的一只调整给乙组，从上面最后一随机数字41，接下去抄一个数为62，以7除之(因甲组原分配7只)得余数为6，即把原分配在甲组的第6个甲(即11号大鼠)调入乙组。如果甲组多两个，则接下去抄两个数。分别以8、7除之，余数即指要调入乙组的第几个甲，余此类推。最后各组的鼠数就相等了，调整后各组鼠的编号为：,48,例：设有雄性的SD大鼠12只，试用完全随机的方法，分为A、B、C三组。,分为三组,分组方法：按体重大小依次编为1、2、3、12号，假设所定的点是随机数字表第40行17列的08，则从08开始，自左向右抄12个随机数字：,动物编号123456789101112随机数字082701501529394243796910,除3余数201202001101组别BCABCBCCAACA,以3除各随机数字，若余数为1，即该鼠归A组；余数为2，归入B组；余数为0，归入C组。结果A组为4只，B组3只，C组5只。C组多一只应调入B组，方法同上。,A组391012B组1246C组57811对于将动物随机分为四组或更多组原理基本一致。,仍采用随机方法，从10后面接着抄，为61。除以5，余数为1，则将第一个C，即第2号鼠调入B组，调整后各组鼠的编号如下：,49,例：设有A、B、C、D、E、F代表的6只家兔，试用完全随机法将其每只分为一组。分组方法：从随机数字表上用铅笔任指一点，若为第21行第17列的33，则从33向左抄用6个数字，然后分别以6、5、4、3、2、1除之。凡除不尽的，即将余数写下。除尽的，即将其除数写下。如下：随机数字3346952687除数654321余数311121随机排列CABDFE上列第一个随机数字余数为3，意即将六个字母中列在第三位的字母C写在该数下，第二个数字的余数为1，即在剩下的五个字母列在第一位的A写在该数字下面，余此类推。六个字母相应号代表的兔随机排列结果见上表最后一行。,每个动物分为一组,50,一、性别鉴定,1.啮齿目,大鼠、小鼠可用肛门生殖器间距离加以区分。成年大、小鼠性别极易区别：雌性生殖器与肛门之间有一无毛小沟，距离较近；雄性可见明显的阴囊，生殖器突起较雌鼠大，肛门和生殖器之间长毛，距离较远；也可以通过乳头的出现来区分大、小鼠。雌性小鼠213日龄可见乳头的出现；雌性大鼠3日龄就可见乳头，1215日龄更明显，此后两种鼠的乳头就被被毛遮掩。幼年鼠则主要靠肛门与生殖器的距离远近来判别，近的为雌性，远的为雄性。,动物的性别鉴定与日龄判断,51,2.兔形目,对初生仔兔及开眼仔兔，可观察其阴部孔洞形状和距离肛门远近：孔洞扁形、大小与肛门相同，距肛门近者为雌性；孔洞圆形而略小于肛门，距肛门远者为雄性。对幼兔，可用右手抓住兔的颈背部皮肤，左手以食、中指夹住尾巴，大拇指轻轻向上推开生殖器：局部呈“O”形，下为圆柱体者是公兔；局部呈“V”形，下端裂缝延至肛门者为母兔。对成年兔，可看有无阴囊。3月龄以上家兔，只要看一眼有无阴囊，便可区分公母。,52,二、日龄判断,(一)小鼠,1.根据形态鉴定日龄,小鼠出生后不同时间的外观形态特征日龄(d)外观形态特征日龄(d)外观形态特征1仔鼠裸体鲜红10能听到声音3耳壳露出表皮911全身被上臼毛，门齿长出4脐带疤痕脱落1315眼皮张开，能跳跃，能抓取东西5能翻身18以后能自行采食，独立生活8能爬行,2.根据体重鉴定日龄,小鼠不同日龄的体重日龄(d)体重(g)日龄(d)体重(g)初生1.82015.054.02521.0106.03021.01511.0,53,（二）大鼠,18日龄以前大鼠的形态特征与小鼠基本一致，可根据形态特征来判断年龄。在无可靠记录资料的情况下，可根据体重来判断大致日龄。即使同一品系的大鼠，其生长发育受窝产仔数、雌鼠哺乳能力、饲料营养水平、管理水平以及个体差异等多种因素的制约，所以年龄与体重的关系不是绝对的。,日龄(d)