第五章--生物质谱仪器与技术

第五章生物质谱技术与仪器,谢圣高,2,重点提示,1.质谱仪的工作原理是什么？2.质谱仪有哪些主要部分？其主要作用是什么？对质谱仪的性能有何影响？3.质谱仪中的质量分析器主要有几种？各自有什么特点？4.质谱仪中常见的离子源有哪些？它们的主要特点是什么？5.质谱联用技术有哪些？各有什么主要特点？6.质谱仪在生物医学领域中有哪些主要应用？7.同位素稀释-质谱法（ID-MS）的原理和主要特点是什么？8.什么叫MALDI-TOF-MS？它有什么主要应用？,目录,第一节质谱仪第二节质谱联用技术第三节质谱仪在生物医学领域中的应用本章小结,第一节质谱仪,质谱仪离子源中的样品，在极高的真空状态下，在电子、电场、光、热或激发态原子等能量源作用下，将物质气化、电离成正离子束，经电压加速和聚焦导入质量分析器中，一般利用离子在电场、磁场中运动的性质，按离子质荷比(m/z)的大小顺序进行收集和记录，得到质谱图。也可以按质荷比-相对强度或离子强度列表，得到质谱表。,一、质谱仪的工作原理,质谱图,纵坐标为离子相对强度：以离子强度最强峰为100，其他的峰则以此为标准，确定其相对强度，又称相对丰度；或为离子强度（离子流强度）横坐标为质荷比。,质谱图,一、质谱仪的工作原理,二、质谱仪的组成,7个部分：真空系统进样系统离子源加速器质量分析器检测器计算机系统,质谱仪的基本结构框图,+,+,检测器,质量分析器,闪烁计数器：由闪烁体(也称荧光体)和光电倍增管构成,二、质谱仪的组成,（一）真空系统,覆盖区：凡是有样品分子和离子存在的区域。作用：降低背景；减少离子间或离子与分子间碰撞所产生的干扰，如散射、离子飞行偏离、质谱图变宽等；延长灯丝寿命（残余空气中的氧能烧坏离子源的灯丝）。真空度：1.010-41.010-7Pa。特别是质量分析器要求高真空度。,二、质谱仪的组成,（二）进样系统,根据是否需要接口装置，分为两种方式：,2.通过接口进样：将气相色谱（GC）载气去除或将液相色谱(LC)的溶剂去除后导入质谱。GCMS,LC-MS,二、质谱仪的组成,2020/5/31,（三）离子源（ionsource）,使气化样品中的原子、分子电离或分子碎片成为正离子，又称为电离源。离子源与质谱仪的性能直接相关“”表示未配对的单电子，“+”表示正离子。分子失去一个电子而电离所产生的自由基离子，称为分子离子（）。分子离子进一步发生键的简单断裂，而产生质量数较低的碎片，即失去游离基（自由基）后的正离子，称为碎片离子,常见的分子破碎过程示意图,二、质谱仪的组成,常见离子源电离方式,电子电离（EI）化学电离（CI）场电离（FI）场解吸（FD）快原子轰击（FAB）电喷雾电离（ESI）大气压化学电离（APCI）基质辅助激光解吸电离（MALDI）电喷雾解吸电离(DESI),二、质谱仪的组成,1.电子电离源（EI）原理：用电加热铼或钨丝至2000，产生1070eV的高速电子束，与进入电离室的试样分子发生碰撞，若电子的能量大于试样分子的电离电位，将导致试样分子的电离。试样分子M失去一个电子形成的M+称为分子离子。所需能量为1520eV。当具有更高能量（如70eV）的电子轰击有机化合物分子时，就会使分子中的化学键断裂，生成各种低质量数的碎片离子和中性自由基。,加速,聚焦,加速,2.化学电离源（CI）,样品分子在承受电子轰击前，被一种反应气体(通常是甲烷)稀释，稀释比例约为104:1，因此样品分子与电子的碰撞几率极小，所生成的样品分子离子主要经过离子-分子反应组成。,应用强电场诱导样品电离：(电压：710kV，d10:1。如果仪器的信噪比达不到10，即灵敏度达不到1pg，则要加大进样量，直到有合适大小的信噪比为止。再用此时的进样量及信噪比表示灵敏度。,四、质谱仪的性能指标,（三）质量范围,指质谱仪所检测的离子质荷比（m/z）范围。如果是单电荷离子即表示质谱仪检测样品的相对原子质量（或相对分子质量）范围，采用以12C定义的原子质量单位（atomicmassunit，amu，1amu1u1Da）来量度。质量范围的大小取决于质量分析器。使用时要根据分析对象来选择。,四、质谱仪的性能指标,（四）质量稳定性和质量精度,质量稳定性是指仪器在工作时质量稳定的状况，通常用一定时间内质量漂移的幅度来表示。例如：某仪器的质量稳定性为：0.1amu/12h，是指该仪器在12小时之内，质量漂移不超过0.1amu。质量精度是指质量测定的精确程度（准确程度）。常用相对百分比表示。例如：某化合物的质量为1520473amu，用某质谱仪多次测定该化合物，测得的质量与该化合物理论质量之差在0.003amu之内，则该仪器的质量精度约为十亿分之二（2ppb）。质量精度是高分辨质谱仪的一项重要指标，对低分辨质谱仪没有太大意义。,四、质谱仪的性能指标,第二节质谱联用技术,第二节质谱联用技术,质谱联用技术如GC-MS、LC-MS，先将有机混合物分离成纯组分后再进入质谱仪分析，充分发挥色谱仪分离特长与质谱仪的定性鉴定特长，使分离和鉴定同时进行。为了增加未知物分析的结构信息，采用串联质谱技术（质谱-质谱联用），也是目前质谱技术发展的一个方向。毛细管电泳-质谱联用技术,一、气相色谱-质谱联用技术(GC-MS),使用气相色谱仪在合适的色谱条件下将混合样品分离成单个组分，分离的样本通过质谱仪鉴定的技术。GC-MS系统主要组成。气相色谱部分、质谱部分和计算机系统。GC-MS适用对象：小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合物。图谱分析特点：通过EI得到的谱图，可与标准谱库对比。,气相色谱仪利用一定温度下样品中不同化合物在流动的气相和固定的液相中分配系数的不同，先后在色谱柱中流出而分离。保留时间是气相色谱进行定性的依据，而色谱峰高或峰面积是定量的手段。GC-MS的接口色谱仪是在常压下工作，而质谱仪需要高真空，因此，如果色谱仪使用填充柱，必须经过接口装置将色谱载气去除，使样品气进入质谱仪。如果色谱仪使用毛细管柱，则不需要接口装置，可以将毛细管直接插入质谱仪离子源，因为毛细管载气流量比填充柱小得多，不会破坏质谱仪真空。,一、气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）,质谱仪将气化后的样品离子按质荷比测定各成份的分子量、分子式、结构信息及定量分析。MS离子源主要是EI源和CI源；质量分析器目前使用最多的是四极杆质谱仪。计算机系统控制GC-MS系统的主要操作储存、分析数据,一、气相色谱-质谱联用技术(GC-MS）,GC-MS应用,主要用于有机物的分离与鉴定遗传代谢性疾病的筛查和诊断：疾病种类多，可同时筛查氨基酸、有机酸、糖代谢异常及脂肪代谢紊乱等共100余种疾病；适用样本种类多，包括血液、尿液、脑脊液、唾液、汗液、羊水等。尿液类固醇激素的谱分析,一、气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）,二、液相色谱-质谱联用技术(LC-MS),LC-MS系统组成：高效液相色谱部分、接口装置（同时也是离子源）、质谱部分和计算机系统。LC-MS系统适用对象：不挥发性化合物、极性化合物、热不稳定化合物、大分子化合物（包括蛋白质、多肽、多聚物等）。图谱分析特点：没有商品化的谱库可对比查询，只能自己建库或解析。,高压液相色谱仪在高压下利用样品中不同化合物在流动的液相和呈固态的固定相中分配系数的不同，先后在色谱柱中流出而分离。色谱产物再导入质谱仪作进一步定性、定量分析。LC-MS高效液相色谱的接口和离子源由于液相洗脱剂的流量较气相色谱的载气要大得多,因而LC-MS联用必须通过接口装置，主要作用是去除溶剂并使样品离子化。常用的LC-MS接口是电喷雾接口和大气压化学电离接口，兼作电喷雾电离(ESI)和大气压化学电离(APCI)的离子源。,二、液相色谱-质谱联用技术(LC-MS),接口是连接气相色谱单元和质谱单元最重要的部件。接口的目的是尽可能多地去除载气，保留样品，使色谱柱的流出物转变成粗真空态分离组分，且传输到质谱仪的离子源中。GC/MS联用仪中接口多采用直接连接方式，即将色谱柱直接接入质谱离子源。其作用是将待测物在载气携带下从气相色谱柱流入离子源形成带电粒子，而氦气不发生电离而被真空泵抽走。通常，接口温度应略低于柱温，但也不应出现温度过低的“冷区”。在GC/MS仪的发展中，接口方式还有开口分流型、喷射式分离器等。,LC-MS应用新生儿遗传疾病筛选；老年痴呆症的早期诊断；癌症疾病筛查如乳腺癌等；激素、抗排斥药物、磷酸脂、变异血红蛋白、糖化血红蛋白、血药浓度的检测等。,二、液相色谱-质谱联用技术(LC-MS),三、毛细管电泳-质谱联用技术（CE-MS）,毛细管电泳-质谱联用技术一种基于样品各组份间淌度和分配行为差异而实现分离的电泳新技术与单一样本离子组份的质荷比不同的质谱检测技术的联用。CE-MS的应用蛋白质组学、化学药物研究、医学检验以及法医学等领域。CE-MS系统组成毛细管电泳仪、接口装置、质谱仪和计算机系统。,区带毛细管电泳（CZE）最常用ESl是CE-MS首选的离子源CE/ESI-MS接口类型同轴液体鞘流、无鞘接口、液体连接。质量分析器最常见的是四级杆质量分析器,三、毛细管电泳-质谱联用技术（CE-MS）,四、串联质谱技术,空间串联质谱技术（spacetandemmassspectrometry）为了得到更多的有关分子离子和碎片离子的结构信息，采用两个或以上的质量分析器与碰撞活化室串联使用。如Q-TOF、TOF-TOF、Q-Q-Q等，实现多级（n）质谱，常表示为MSn。二级串联（MS-MS，MS/MS）的两个分析器之间有一个碰撞活化室，目的是将前一级质谱仪（MS1）选定的前体离子打碎，由后一级质谱仪（MS2）分析。时间串联质谱技术（timetandemmassspectrometry）只有一个质量分析器，前一时刻选定离子，在分析器内打碎，后一时刻再进行分析。如IT-MS、FT-MS。,前体离子的裂解方式：碰撞诱导断裂（CID）、亚稳裂解、表面诱导解离、激光诱导解离。串联质谱技术的数据获取方式：产物离子扫描、前体离子扫描、中性丢失扫描及选择反应检测。,四、串联质谱技术,串联质谱技术特点当使用GC-MS、LC-MS时，若色谱仪未能将化合物完全分离，串联质谱技术可以通过选择性测定某组分的特征性前体离子，获取该组分的结构和量的信息，而不会受到共存组分的干扰。GC-MS/MS、LC-MS/MS均可降低对样品处理的选择性要求，测定快速、节省材料。,四、串联质谱技术,串联质谱技术特点在未知化合物的结构解析、复杂混合物中待测化合物的鉴定、碎片裂解途径的阐明以及低浓度生物样品的定量分析方面具有很大优势。采用产物离子扫描可用于7肽和蛋白质碎片的氨基酸序列检测。采用中性丢失扫描可用于寻找具有相同结构特征的药物代谢物分子。采用选择反应离子检测可消除生物基质对低浓度待测化合物定量分析的干扰，从而实现对待测物特别是血药浓度的高特异、高灵敏分析。,四、串联质谱技术,第三节质谱仪在生物医学领域的应用,生物质谱技术生物样品离子化的质谱技术，以ESI和MALDI等为代表的质谱技术。临床应用生物标志物检测（小分子、大分子）微生物鉴定治疗药物监测(TDM),第三节质谱仪在生物医学领域的应用,本章小结,1.质谱仪作用与组成：将分析物气化形成离子后按质荷比(m/z)分开而进行定性、定量和结构分析，主要由真空系统、进样系统、离子源、加速器、质量分析器、检测器及计算机系统所组成，其核心是离子源和质量分析器。2.离子源常见的电离方式：使气化样品中的原子、分子或分子碎片电离成正离子。常见的电离方式有电子电离（EI）、化学电离（CI）、场电离（FI）、场解吸（FD）、快原子轰击（FAB）、电喷雾电离（ESI）、大气压化学电离（APCI）、基质辅助激光解吸电离（MALDI）和电喷雾解吸电离(DESI)等。其中，EI属于硬电离，其他都属于软电离。软电离方式易得到准分子离子峰，硬电离方式一般只能得到碎片离子。,本章小结,3.质量分析器：只用磁场的单聚焦分析器，既用电场又用磁场的双聚焦分析器、傅立叶变换离子回旋共振分析器，只用电场的四极杆分析器、离子阱分析器，既不用电场也不用磁场的飞行时间分析器。4.五种质谱仪：磁质谱仪（单聚焦与双聚焦质谱仪）、四极杆质谱仪（Q-MS）、离子阱质谱仪（IT-MS）、飞行时间质谱仪（TOF-MS）和傅立叶变换质谱仪（FT-MS）。5.质谱仪的主要性能指标是分辨率、灵敏度、质量范围、质量稳定性和质量精度等。其定义与常见的临床检验仪器性能指标有所不同，要注意区别。,本章小结,6.质谱联用技术如GC-MS、LC-MS、CE-MS，先将有机混合物分离成纯组分后再进入质谱仪分析，充分发挥色谱仪分离特长与质谱仪的定性鉴定特长，使分离和鉴定同时进行。还用空间串联质谱仪如Q-TOF、TOF-TOF、Q-Q-Q等，质量分析器之间有碰撞活化室，可以得到更多的分子离子和碎片离子的结构信息。7.生物质谱是指对生物样品以ESI和MALDI等离子化为代表的的质谱。生物质谱在生物标志物检测、微生物鉴定和治疗药物监测等检验医学领域的应用日益广泛。其中，同位素稀释质谱法(ID-MS)是测定无机离子、单糖类、脂类、小分子含氮化合物等小分子生物标志物的决定性方法，其一级参考测量