基因敲除技术及其进展

基因敲除技术的研究进展及其在代谢工程中的应用the current status of gene knockout and its application in metabolic engineering天津大学化学学院200年6月摘褥子挖空技术在20世纪80年代发展成了微生物代谢工程、动植物改造、功能基因研究中广泛应用的重要分子生物学技术。本文介绍了基因敲除策略及其在代谢工程中的作用，并重点介绍了RNAi、ZFN、TALENs和最近热门的CRISPR/Cas9等四种新敲除策略。最后展望了基因敲除技术，特别是新兴技术在该领域将如何发展，并为敲除技术的进一步发展提供了参考。关键词：基因敲除代谢工程同源重组CRISPR/Cas9ABSTRACTgene knockout is an important molecular biotech which has developed sine 1980。it has been proved efficient in microbial metabolic engineering，Transform of nima ls and plants and functional genomics . in this review，wwwand four new strategies RNAi，zfn，Talens and crispr/ca S9 were highlighted in detail . at last，developing frontiers and applicationsKeywords: gene knockout、metabolic engineering、homologous recombination、crispr/ca S9列表第一章基因敲除技术11.1与挖空相关的背景11.2挖空技术在代谢工程中的应用2第二章基因敲除策略32.1传统挖空战略32.1.1利用同源重组基因敲除32.1.2利用随机插入突变进行挖空42.2新的基因敲除策略52.2.1使用RNA干扰引起的基因敲除52.2.2锌指核酸酶基因靶向技术52.2.3 TALENs目标基因敲除技术62.2.4 CRISPR/CAS9基因敲除技术7第三章展望9参考文献10审计11第一章基因敲除技术1.1与挖空相关的背景随着测序技术的迅速发展，生物体基因功能研究成为当前最热门的课题。现阶段对基因功能的研究主要是削弱或停止某一基因表达，观察生物体的整体功能变化，推测与该基因相关的功能，将该基因与整个生物体的功能相关联，提供最终决定基因功能的依据1。随着功能基因组学研究的进行，相关技术也不断发展和完善，最常用的是基因敲除技术。基因敲除是20世纪80年代末开发的新技术，2007年获得了诺贝尔生理医学奖1。基于DNA同源重组技术和胚胎干细胞技术的这项技术已经发展了30多年，目前在分子生物学、遗传学等多个领域使用了多种敲孔技术2。近年来，多种基因高效的目标修改和调节技术(如ZFNs、TALENS、Cas9等)得到了新的发展。2012年1月，基因组编辑核酸酶技术的Nature Methods杂志被选为年度研究方法3。2012年12月被科学杂志评为2012年十大科学发展之一4。这种技术大大提高了敲孔的效率，具有很大的特异性，因此研究基因功能的新方法必将极大地促进生物学和医学研究的发展。敲孔技术分为完全敲孔和条件敲孔。整个基因敲除是用同种重组方法从细胞或动物个体中完全去除目标基因活性。条件型基因敲除定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除5。在此阶段，条件型基因敲除噬菌体Cre/Loxp系统和葡萄酒质粒的FLP/FRT系统应用最广。敲孔技术从早期的简单完全敲孔到条件敲孔，现在正朝着特定组织的基因敲孔，特定时间的基因敲孔，可调节敲孔的方向前进。但是基因敲除也有不能克服的缺点和缺点。1)在敲除过程中，往往只破坏目标基因的一部分，而不是整个符号区域，其余符号的序列结合了新的未知功能，可能会在表达型分析中出现问题。(2)敲门声截断了某个基因，并不一定能知道该基因的功能。(。原因是很多基因在功能上重复，敲门被移除功能冗余基因不会产生容易识别的表型，因为基因族的其他成员可以提供相同的功能。(3)对于某些必需基因，敲敲是细胞死亡的原因，不能研究这些必需基因的功能。(。(4)实验成本高，同一目标载体在不同遗传背景下基因敲除所得到的表型差异很大6。1.2敲孔技术在代谢工程中的应用特别是代谢工程，通过利用基因工程技术或其他理化方法对细胞的代谢途径进行精确的修改、改造，并扩大、减少、阻断细胞内目标物质的代谢流，或构建新的代谢途径，合理地改变微生物的原始代谢特性，改善或构建新的微生物表型，并与微生物基因调控、代谢调节和生化工程相结合，合成目的代谢产物活性或产量，或新的代谢产物的工程技术科学7。代谢工程的难题是如何使微生物的新陈代谢通过理想的载流量路径流动。发酵生产时，为了达到这个目的，从养分流入细胞到产物生成通常要用三种方法控制8。也就是说，a .从上游和各注入分支出来的碳架物质能顺利流向目的产物；b .切断或去除与目的产物形成无关或不相关的代谢支流，使碳架物质相对集中流向目的产物。c .消除或削弱目标产品额外代谢的方法。在所有这些过程中起重要作用的是酶，相反，基因敲除技术的出现，使其快速失活成为可能，达到调节代谢流和优化代谢途径的目的。通过基因敲除技术研究敲除基因的生物学功能，功能基因的插入和染色体基因的替代也可以成为微生物细胞代谢旁路阻断、毒性/副作用减少、目标产品产量或质量提高、能量消耗减少具有重要产业应用价值的微生物细胞工厂研究的重要内容9。第二章基因敲除策略下一篇文章将通过两个方面讨论典型的挖空策略：挖空技术。第二种是新的基因敲除策略。提供这些策略的简要介绍和概述。2.1传统挖空战略2.1.1使用同源重组基因敲除经典的基因敲除策略是利用同源重组基本原理，在体外转化一定长度/形态的基因，与细胞染色体的目标基因进行同源重组(插入或替换)，从而改变细胞的遗传特性。从同源重组的基本原则到同源重组的基质类型(单/双链、线性/环)、重要蛋白质(RecA酶、RecBCD酶等及噬菌体中功能相似的酶)及功能部位(牙部位)等分子设计，可以开发多种去底色方法，根据同源重组载体进行去底色1.线性单链DNA敲除策略不仅易于构建目标向量，重组效率是双链DNA的10至100倍10；2.利用线性双链DNA进行同源重组是近年来基因敲除方法的热点之一。其优点是避免了更麻烦的基因克隆和质粒载体的构建阶段，通过PCR方法直接扩增，获得了目标同源重组片段。但是，线性双链DNA很容易被细胞内的RecBCD酶分解，为了解决这些问题，在线性双链DNA两侧引入Chi部位，从而保护DNA不被RecBCD酶分解，提高RecBCD酶介导的同源重组效率11。3.建立环形质粒载体，实现目标基因敲除的方法是实现微生物基因敲除的经典策略，主要通过微生物本构的RecA再形成系统(主要包含RecA和RecBCD等蛋白质)发挥作用。RecA蛋白是单链结合蛋白，可促进各种DNA分子间的同种异体联盟、配对、链交换和分支移动。RecBCD由RecB、RecC和RecD三种蛋白质组成，它们与双链切口结合，解开DNA链，在Chi部位形成单链，然后在RecA蛋白质中促进同源重组。RecBCD具有核酸外体酶v的活性，因此线性DNA分子在细菌内分解。因此，同源重组片段的分子设计和构建9必须通过环质粒载体克隆来完成。常用环质粒载体敲除策略有4种12:A.非复制质粒载体敲除对野生菌的基因敲除首先可以考虑使用非复制型载体。因为培养的挖空矢量没有从受体中复制，变形后在选择压力下未重构的变形者不能随着挖空矢量的生长而稀释。B.不稳定质粒载体敲除如果受体易感性比较困难，可以考虑使用不稳定的敲孔载体。这种质粒在受体菌上分布不稳定，如果在无压力选择或低磷条件下培养5 10代，质粒流失细胞就很多。因此，转换后，可以调整培养条件，将敲孔矢量与细胞一起复制，增加转基因体的数量，然后在无压力选择或低磷条件下失去质粒，最后在选择压力下筛选敲孔。C.温敏性(Ts型)质粒载体敲除1993年，Biswas等13利用Ts型质粒构建了革兰阳性细菌的高效基因敲除系统。Biswas使用的质粒pG host5在37 时不复制，在28 时在滚动环模式下复制。因此，如果在转换后的37 进行培养，则在发生第一次同源重组单-克罗斯ver(SCO)后，将温度降低到28 时，质粒会发生滚动复制，这种复制机制可能会导致第二次双孔复制(dco)重组后，目标基因融化或回复到野生型。D.结合转换爆震分割想要基因敲除的目标细菌如果不轻易准备受体作用或受体活性，就可以找到“介质”，进行基因转移过程。2.1.2利用随机插入突变基因敲除突变的大规模随机插入理论上可以清除基因组范围内的所有基因。该技术具有效率、完全禁用基因、易于确认分离等优点。目前更有效的方法是随机插入突变。T-DNA插入突变和转座子插入突变，两者在植物中均被用作广泛的基因敲除手段。A.T-DNA插入失活技术是利用农杆菌A . T . DNA介导的转基因将具有报告基因的DNA序列标签整合到基因组DNA中。可以直接在植物基因组DNA上产生稳定的插入突变，插入部位的随机性比较强，但只适用于容易被T-DNA转换的植物，突变表型与T-DNA插入无关，经常引起遗传分析困难的染色体重排现象。该方法可在拟南芥中产生35%到40%的突变率，19%的突变体具有外观可检测的表型特征。B.转座子插入突变是利用转座子在染色体上移动的特征，当跳跃插入特定功能基因时，该基因可能被停用，并诱导突变。植物特别适合突变插入。因为得到的基因突变在异型合子植物中保持不变，通过Fl代植物自交产生的F2代植物中可以获得纯合子突变植物。利用转座子进行基因敲除非常方便，只有外显者知道，载体具有携带多种不同抗性基因同时处理多种基因的简单结构14。转座子插入突变只适用于存在内源性活性淀粉的植物种类，但这种植物并不多。2.2新的基因敲除策略2.2.1使用RNA干扰引起的基因敲除RNA干扰(RNA Interference，RNAi)是内源性或外源双链双链RNA(DSR na)进入细胞后，在细胞内对自身同系物mRNA进行特定分解，抑制该基因的表达，从而显示细胞缺少特定基因的表型DsRNA在Dicer酶的作用下结合了21-22 nt长度的Siri na(小interf efence RNA)、Siri na分子、核酸酶、螺旋酶(RNA-induced silencing complex)因此，通过将dsRNA分子诱导为人类细胞，特定分解细胞内的同族mRNA，关闭内源性基因表达，不应该死亡的基因也能溶解。2.2.2锌指核酸酶基因靶向技术锌指核酸酶基因目标技术(Zinc finger nucleases，ZFNs)的核心设计理念是融合具有特定功能的两个域，即特定识别模块和功能模块，创建具有特定功能的蛋白质16。单个ZFN的DNA结合域一般由3 6个Cys2 1 His2锌指蛋白重复单元组成，特异性地识别1个三碱基。连接到锌指蛋白组的非特异性核酸内切酶由FokI c端的96个氨基酸残基组成的DNA剪切区域中，每个FokI单体与锌指蛋白连接形成ZFN，识别特定部位，两个识别部位相距6 8bp距离时，两个单体ZFN相互作用引起酶消化。在这个特定部位产生一个