色谱学 lecture 7.ppt

,色谱学第七讲,2011年11月7日,色谱的分类,1,3:normalsaturatedchambers;2,4:ultramicrocham2bers(totallyclosedlayer,withoutoverpressure);5,6,7:OPLCchambers(plateswith11,5,and3mparticlesizes,respectively).,加压薄层色谱法（OverpressuredLayerChromatography）,ImportanceofTheoreticalPlates(N),HPLCChromatographofMuscadineGrapeJuice,Water-SolubleVitamins,Water-SolubleVitamins,高效液相色谱法,H,P,igh,erformance,L,iquid,C,hromatography,H,P,igh,ressure,L,iquid,C,hromatography,H,P,igh,riced,L,iquid,C,hromatography,概述高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。为了更好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方面进行比较：,1高效液相色谱法与经典液相色谱法,高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达103cmmin-1.例如分离苯的羟基化合物，7个组分只需1min就可完成。对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径0.9cm，流动相速度为30cm3h-1，需用20多小时才能分离出20种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lh之内即可完成。又如用25cm0.46cm的LichrosorbODS(5)的柱，采用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中104个组分.,高效液相色谱法特点：,1.高压：一般：150300kg/cm2甚至：500kg/cm22.高速：两相间交换：千分之几秒分析时间较经典法少很多(几分几十分钟)3高效：气相：2000塔板/米液相：5000塔板/米4.高灵敏度：紫外检测器：109g数量级荧光检测器：1011g(百万分之几）试样量小（几微升）5.高选择性：可分析在性质上极为相似化合物（手性化合物、同位素、同分异构、空间异构）,与气相色谱比较：相同点：都是重要的分离、分析手段气相的基本理论（塔板理论、定性定量方法）基本术语（色谱参数、色谱图、色谱柱效）不同点：应用范围：气相：易挥发、热稳定液相：不易挥发、热不稳定但具有一定溶解性化合物，不适合气体。流动相作用：气相：运载样品，不影响色谱分离液相：运载样品，参与、影响色谱分离，且起主要作用。分析样品：气相：破坏样品，不能回收。液相：不破坏样品，能回收。说明：,高效液相色谱,高效液相色谱仪,高效液相色谱仪的结构一般可分为4个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。,19,进样系统,高压输液装置,分离系统,检测系统,色谱仪器系统比较,GCSystem,I高效液相色谱仪,高效液相色谱仪的流程,高效液相色谱仪的高压泵,高效液相色谱仪的检测器,高效液相色谱仪的生产厂家,高效液相色谱仪的分离柱,流程,仪器装置液相色谱仪可分为四大系统：泵系统进样系统分离系统检测系统,泵系统,泵系统发展趋势,高效：填料颗粒分离效率柱压降泵的工作压力分析时间短：更快流速柱压降减少洗脱液用量液相色谱的多元洗脱系统,泵的分类,进样系统,高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约530cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起往前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。,进样阀,六通阀,高效液相色谱仪的色谱柱,球形填料,不规则形填料,高效液相色谱仪的检测器,紫外可见分光光度检测器,特点:,应用广泛、灵敏、线性宽温度不敏感流动相流速不敏感、可梯度,10-9g/ml,二极管阵列检测器,特点:,可得到吸收光谱定性功能强峰纯度检验,10-8g/ml,光电二极管阵列检测器,荧光检测器,Stokes荧光,F=2.3QKI0bC,10-12g/ml,特点:,特征性强、灵敏,示差折光检测器,示差折光光路结构示意图,R=ZC（ni-n0）,10-6g/ml,6高效液相色谱仪的生产厂家,Waters,Agillent,Shimadz,PerkinElmer,Varian,大连依利特公司,北京东西电子研究所,制造商,高效液相色谱仪LC-2010HT岛津（香港）有限公司,返回,II液相色谱的基本分离模式,反相液相色谱,正相液相色谱,离子交换色谱,离子色谱,亲和作用色谱,体积排阻色谱,疏水作用色谱,1含义固定相-极性，流动相-非极性2分离机理,溶质和固定相及流动相之间的分子作用力，其中氢键力和静电力起着重要的作用,正相液相色谱,NORMALPHASE,1980200430%5%SilicaGel47%44%SilicabasedbondedphasesDiolAminoCyano3%1%Alumina20%50%ChiralBondedPhases,4正相色谱的流动相,常用己烷、环己烷，乙醚、四氯化碳、二氯甲烷、甲醇、乙腈、异丙醇、四氢呋喃等,正相色谱常用溶剂的极性参数及其溶剂冲洗强度,5正相色谱的应用,主要应用于甾醇类、类脂化合物、磷脂类化合物、脂肪酸以及其他有机物,环境中有机氯农药残留量分析固定相：薄壳型硅胶(3750m)流动相：正己烷流速：1.5mL/min色谱柱：50cm2.5mm(内径)检测器：差示折光检测器,可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。,反相色谱reversedphasechromatography,RPC,固定相：非极性的反相介质，即为疏水性介质(R1,R2多为甲基，R为C4，C8，C18烷基或苯基，其中C18硅烷化制备的试剂最多，统称为ODSOctadecylsilica)。烷基化密度：45%，55%的羟基用三甲基氯硅烷覆盖，使表面完全非极性化。溶质在介质上的分配系数处决于溶质的疏水性，疏水性大，m高。流动相：极性有机溶剂的水溶液(甲醇,乙晴,异丙醇、正丙醇和四氢呋喃等)洗脱：有机溶剂增加。,2分离机理,反相液相色谱,3反相色谱的色谱柱（固定相）常用的固定相-非极性的化学键合相。C18，C8，C4等。,反相HPLC-固相载体化学键合相,C-2EthylSilyl-Si-CH2-CH3,CNCyanopropylSilyl-Si-(CH2)3-CN,C-18OctadecylSilyl-Si-(CH2)17-CH3,C-8OctylSilyl-Si-(CH2)7-CH3,80%Octadecylsilica(ODS,C18)10%Octylsilica(C8)5%Butylsilica(C4)3%Phenyl2%Cyano(CN),反相色谱的色谱柱,4反相色谱的流动相,通常用的有水、甲醇、乙醇、乙睛等，可用醋酸、磷酸调节PH值，用三乙胺作为碱性添加剂改善色谱峰的形状。,反相色谱常用流动相溶剂的物理性质,5反相色谱法具有以下特点,（1）柱子使用寿命较长（2）流动相可灵活选择（3）应用范围特别广泛,反相色谱的保留机理疏溶剂理论双保留机理分离对象：同系物：烷烃数tR直链tR支链tR化合物极性tR固定相对组分保留的影响：碳链长度：碳链tR烷基覆盖量：覆盖量tR,反相色谱中流动相选择,水有机改善剂常用：甲醇、乙腈、四氢呋喃、二氧六环极性：有机改善剂水洗脱能力：有机改善剂水极性顺序：甲醇乙腈二氧六环四氢呋喃洗脱顺序：水甲醇乙腈二氧六环四氢呋喃,反相键合相色谱的优点,流动相可选用水溶性.样品的溶解度范围提高.流动相可变性大.柱重现性好固定相表面化学能低.平衡容易.梯度洗脱固定相选择多固定相耐溶剂冲洗热稳定性好,缺点：,流动相PH范围要控制（PH28）PH太低：Si-C键易断裂PH太高：硅胶基质易溶解游离的硅羟残基影响分离,6反相液相色谱的应用,占液相色谱的70-80%小分子有机物、农药、氨基酸、低聚核苷酸、肽生物大分子核酸、蛋白质等（50KD）,稠环芳烃的分析,稠环芳烃多为致癌物质。,固定相：十八烷基硅烷化键合相流动相：20%甲醇-水100%甲醇线性梯度淋洗，2%/min流速：1mL/min柱温：50C柱压：70104Pa检测器：紫外检测器,Reversed-Phasevs.NormalPhase,Separationof2-Me-Phenoland4-Me-PhenolinRPandNP,Reversed-PhaseMeOH/Water,Luna-C18,NormalPhaseHexane/IPA,Luna-Si,90/10,60/40,95/5,98/2,Tocopherols,TocopherolsTocotrienolsR1R2a-Tocopherol(a-T)a-Tocotrienol(a-3)_MeMeb-Tocopherol(b-T)b-Tocotrienol(b-3)MeHg-Tocopherol(g-T)g-Tocotrienol(g-3)HMed-Tocopherol(d-T)d-Tocotrienol(d-3)HH,Tocotrienols,Genesissilicacolumn(250 x4.6mm,4m).Mobilephase:Hexane-1,4-dioxane(96:4).J.Chromatogr.A,881(2000)217-227,SeparationofsynthetictocopherolsbyreversedphaseHPLC(280nm):1)d-tocopherol,2)g-tocopherol,3)b-tocopherol,4)a-tocopherol,5)a-tocopherylacetate,FoodChemistry,76(2002)357362.,ExperimentalComparisonofNPandRPHPLC,液液色谱法的固定相由载体与固定液构成载体:全多孔型或薄壳型涂渍适当的固定液化学键合固定相,液-液分配色谱法固定相,利用化学反应的方法通过化学键把各种不同的有机分子（固定液）键合到载体表面，这样制得的填料称化学键合相，简称键合相。其优点是：使用过程中固定液不遗失；化学性能稳定，在pH28的溶液中不变质；热稳定性好，一般在70以下稳定；选择性好；利于梯度洗脱。,化学键合固定相,这类键合相表面键合的是极性很小的烃基，如十八烷基(C18）、辛烷基（C8）、甲基与苯基等。其中以十八烷基硅烷键合硅胶（或称ODS）应用最为广泛，在化学键合相中约占80。它适合分离非极性或极性小的试样。在应用中可选用极性较强的溶剂，如水。甲醇、乙醇或无机盐的缓冲液作流动相。十八烷基键合相（ODS键合相）是将十八烷基氯硅烷试剂与硅胶表面的硅羟基，经多步反应生成ODS键合相。,非极性键合相,晶体电阵计算:硅胶表面的硅羟基密度为8个/nm2。化学法测定:5个/nm2，,Si-OH+HO-RSi-OR+H2O它的反应条件是在150-250度下反应3-8小时HPLC早期的一种正相键合填料,Si-O-Si键型（