NGS测序技术与分析流程图

第一代测序技术，Sanger测序，1977年桑格测定第一个基因组序列的是噬菌体x74的全长5375个碱基，Sanger法的核心原理是ddNTP的2和3不含羟基，在ddNTP的合成过程中无法形成磷酸二酯键在能够中断DNA合成反应的4个DNA合成反应体系中分别添加带有一定比例的放射性同位素标记的DDNTP(DDAP、ddCTP、ddGTP和ddTTP )，通过凝胶电泳和放射线自显影可以决定测定对象分子的DNA序列，介绍下一代序列决定， 三大数组决策平台的前世生涯，LynxMPSS、Solexa、ABISOLiD 454、IonTorrent、Helicos、SMRT、illuminatsuxa、Roche454、PolonySeq、ABIIonTorrent、Pacific bion 2005年底，454家公司发布了基于革命性焦磷酸测序法的超高吞吐量基因测序系统GenomeSequencer20System，在Nature杂志上发表了里程碑事件，并在合成的同时进行测序此后，454家被罗氏诊断公司以1.55亿美元收购。 454测序原理，测序实验流程：1，文库制备：根据样品种类和实验目的，将基因组DNA/cDNA分段处理在400-800bp之间，经末端修复和特异接头连接等改性后改性处理回收单链DNA(sstDNA )； 并且，与两个44碱长的连接子(adaptor)A、b平行连接。 a、b连接体分别含有20个PCR引物序列、20个测序序列和4个对照序列(TACG )，b连接体5端标记一个生物素基团，用于分离后续适当测序模板测序实验流程：2，EmulsionPCR :特定比例的单链DNA文库固定在特别设计的DNA捕获珠中，大多数珠具有独特的单链DNA片段。 磁珠结合的文库经扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，独特的片段在自己的微反应器中独立扩增，不受其他竞争和污染性序列的影响。 整个分段库的放大是并行的。 放大之后有了数百万份同样的复印件。 之后，乳液的混合物被破坏，扩增后结合珠粒的片段被回收精制，可以用于之后的测序实验，测序实验的流程：3，测序反应：将具有DNA的珠粒和其他反应物的混合物放入PTP板中，将下一个测序PTP孔的直径(29um )只能容纳一个珠子(20um )。 然后，将PTP板放置在GSFLX中，并且开始排列确定。 与模板链互补的核苷酸添加产生化学发光信号，由CCD相机捕获的测序实验过程：4，数据分析： gsfslx系统在10小时运行中获得100多万个读取长度，读取4-6亿个碱基以上的信息，通过gsfslx系统454Pyrosequencing，454的特点和主要应用，读取长度长，400-600bp通量低，1Run1M序列，400-600Mb相对成本高的主要应用： denovonoo序列，illuminasolexa，solexa 、IlluminaSolexa网桥PCR、diol、diol、1stcycledenaturation、IlluminaSolexaBaseCalling，ttttttttttttttttgt、TGCTACGAT diol、1stcycledenaturation、 illuminatsuxaa的特点每日120-150 g run的主要应用： RNA序列决策、表观学研究、ABISOLiD、solidsequenceingbyoligoligation/detect oligo连接序列决策：用连接酶连接、ollidsequenceingbyoligoligation/detect oligo连接序列决策SOLiD5500 xl、ABISOLiD序列决定前调制a样品碎片珠连接、b乳化PCR3末端修饰、c珠浓缩转移到测序，ABISOLiD测序原理、ABISOLiD荧光结合和结果例， SRR 02969.1 vab _ 5551 _ 12 _ 381 _ F3长度=35t 11.0203.3.1113213211302330201 SRR 02969.1 vab _ 5551 _ 381 _ F3长度=3536！ 8/8: 4626=(8.)43 )、(95，A.SOLiDOligo荧光基示意图，B.SOLiD测序结果实例(ColorSpace )，SOLiD特征及主要应用，读取长度短，50-75bp精度高，Q40通量高，20-30G每日1Run Iontorrent、ion torrent shanking的原理、精确度，例如SNP检测，examples :90 % con dence (10 % error te )=q 1099 % con dence (1% errorrate )=q 2099.9 % con dence (.1 % 3个平台技术差异3种平台性能参数差异、转录组序列决策过程、转录组主要分析内容、小RNA序列决策、果蝇3种组织中MiRNA表达情况、MiRNA表达模式分析、新MiRNA预测、 MiRNA编辑情况分析和统计，分析软件介绍质量控制(QualityControl )定位软件(Mappingthereads )已知基因(差异)表达评价软件(DifferentialExpression )新基因鉴定软件(newgeneident ) 基因功能注释软件(GOtermorKEGGpathwayanalysis )、数据格式示例、Fastq格式、ColorSpace格式、Phredscore、质量管理、galaxy的原始数据处理， https:/主页. g2. bx.PSU.edu /，GalaxyHistoryVGNFASTQ，https:/主页. g2