第二章生物样品的制备

第二章生物样品的制备,目录,2.1生物分析化学分析对象的复杂性2.2生物材料的选择2.3激光捕获显微切割技术2.4细胞的破碎2.5生物大分子提取2.6生物大分子的分离与纯化2.7固相萃取与固相微萃取,分析对象：生物大分子-蛋白质、多肽、核酸、多糖生物小分子-具有生物活性的小分子化合物（内源性小分子、外源性小分子）复杂性：组成、含量、动力学范围、时空依存性,生物分析化学的样品制备特点：（1）生物样品的组成极其复杂（2）许多生物分子的含量极微（3）具有很宽的动力学浓度范围（4）提取制备过程中极易失活（5）实验结果易受操作的影响,制备生物分子的基本原则：（1）确定要制备的生物分子的目的和要求（2）掌握目标产物的物理、化学及生物学性质（3）生物材料的破碎和预处理（4）分离纯化方案的选择和探索（5）选择相应、可靠的分析技术（6）产物的浓缩、干燥和保存,样品处理需要考虑的生物分子的物理、化学及生物学性质：（1）在水和各种有机溶剂中的溶解度（2）在不同温度、pH的溶液和各种缓冲液中的稳定性（3）固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性（4）各种物理性质分子大小、穿膜能力、带点情况、离心沉降表现（5）化学性质对各种化学试剂的稳定性（6）对其他生物分子的亲和力（7）在细胞内的定位等,分离纯化基本原理：利用混合物中几个组分分配系数的差异物理力场,生物材料来源于动物、植物和微生物及其代谢产物，应尽可能选择含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低的生物材料。,植物材料：季节性、地理位置、生长环境动物材料：年龄、性别、营养状况、遗传因素、生理状态微生物：菌种代数、培养基成分之间的差异,材料选定后加工处理：动物组织：去结缔组织、脂肪、破碎细胞植物：去壳、除脂微生物：菌体与发酵液分开生物材料-冰冻保存,激光捕获显微切割技术（LCM）是在显微状态或显微镜直视下通过显微操作系统对欲选取的材料（组织、细胞群、细胞、细胞内组分或染色体区带等）进行切割、分离，获取均匀性很好的目标细胞，以用于后续研究的显微分离收集技术。,2.3.1LCM的特点,（1）LCM可以从任何组织中快速、精确地分离出纯的特异细胞及细胞群。（2）利用显微切割技术实在组织细胞或染色体的原位取材，因此，所取材料的定位清楚，所研究对象的历史背景明确。（3）显微切割技术可以保证所取材料在一定层次上的同质性。（4）LCM可以与多种分子生物学、免疫学及病理学技术结合使用。,2.3.2LCM的仪器与操作,1.PixCellIIeLCMSystem倒置显微镜，光束不动，载物台移动，激光逐点打到样品区,2.LaserMicro-Dissection正置显微镜，紫外激光束自动扫描切割样品边缘,LCM切割原理图,LCM实例与应用广泛应用于各种肿瘤研究,A：正常细胞;B：腺瘤;C：癌组织。,激光显微捕获大肠癌细胞,1：H4：切割下的上皮细胞。,各种细胞破碎方法的应用范围,2.5.1水溶液提取,影响因素,盐浓度（离子强度）,pH,温度,防止降解作用,搅拌与氧化,2.5.2有机溶剂提取,对于一些难溶的蛋白质和酶，常用不同比例的有机溶剂提取。常用有机溶剂：乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等。有些蛋白质和酶既能溶于稀酸、稀碱，又能溶于含有一定比例的有机溶剂的水溶液中，在这种情况下，采用稀的有机溶液提取常常可以防止水解酶的破坏，并兼有去除杂质、提高纯化效果的作用。,2.6.1离心技术（centrifugetechnique）,离心技术是根据颗粒在作迅速圆周运动时受到一个外向的离心力的行为为发展起来的一种分离技术。具有比较温和、分离样品量大等特点。,离心作用是根据在一定角速度下作圆周运动的任务物体都受到一个向外的离心力进行的。相对离心力（relativecentrifugalforce，RCF）：RCF=F离心力/F重力,离心力与相对离心力,沉降系数S：颗粒在单位离心力作用下的陈啊静速度称该颗粒的沉降系数。斯维得贝格单位（Svedbergunit）:10-13S沉降速度：在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离。K系数：用来描述在一个转子中，将粒子沉降下来的效率。,沉降系数、沉降速度、K系数,1）差速离心法-不同粒子在离心力场沉降的差别粗制品提取2）速率区带离心法-粒子在梯度液中沉降系数不同3）等密度离心法-粒子颗粒密度不同,离心技术的分类,理想梯度材料特点：完全惰性，易分离黏度低，渗透压低，离子强度和pH变化较小无腐蚀作用易纯化，成本低浓度便于测定物理性质、热力学性质已知,梯度溶液的制备,梯度材料的应用,沉淀是溶质从溶液中析出的过程。操作简便、成本低原理：根据不同溶质在溶剂中溶解度不同从而使其分离通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相。,2.6.2沉淀法,1,中性盐沉淀（盐析法）,中性盐的选择硫酸铵,盐析的操作方法固体硫酸铵加入法,盐析的影响因素,蛋白质的浓度,pH,温度,2,有机溶剂沉淀法,基本原理：降低水溶液的介电系数,有机溶剂的选择和浓度的计算乙醇、甲醇、丙酮V=V0(S2-S1)/(100-S2),影响因素,温度,样品浓度,pH,离子强度,3,选择性变性沉淀法,热变性,有机溶剂变性非目的物变性沉淀,选择性酸碱变性,4,等电点沉淀法：利用具有不同等电点的良性电解质在达到中性时溶解度最低，易发生沉淀的性质，从而实现分离的方法,5,有机聚合物沉淀法：早起应用于提纯免疫球蛋白及沉淀一些细菌和病毒。近年来应用于核酸和酶的纯化。,PEG沉淀解释：聚合物与大分子发生共沉淀作用亲水性强，生物大分子脱水以氢键形成复合物，在重力作用下沉淀空间位置排斥排斥,2.6.3透析,透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一，在生物大分子制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。只需要使用专用的半透膜即可完成。,2.6.4超滤,超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制薄膜，并使大分子溶质不能通过，留在膜一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。,微孔过滤、超滤、反渗透,2.6.5冰冻干燥,冰冻干燥是指将生物大分子的水溶液冰冻，然后在低温和高真空下使冰升华，留下固体干粉的过程。,特点：样品不起泡、不沸腾不黏壁、易取出易溶于水,注意事项：样品溶液样品溶液的容器溶液冰冻冻干,固相萃取（SPE）是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物的目的。,2.7.1固相萃取的模式及原理,固相萃取实质上是一种液相色谱分离，其主要分离模式与液相色谱相同，可分为正相、反相、离子交换等几种类型。固相萃取所用的吸附剂也与液相色谱常用的固定相相同，只是在粒度上有所区别。,吸附剂：正向固相萃取-极性反相固相萃取-非极性或极性较弱,2.7.2固相萃取常用的吸附剂,固相萃取实质上是一种液相分离，故原则上讲，可作为液相色谱柱填料的材料都可用于固相萃取。固相萃取中的吸附剂的选择主要根据目标化合物的性质和样品基体性质。目标化合物的极性与吸附剂的极性非常相似时，可以得到目标化合物的最佳吸附。,选择分离模式和吸附剂：溶解度是否可能离子化是否形成共价键吸附点竞争度,2.7.3固相萃取的装置及操作程序,操作程序,（1）活化吸附剂,（2）上样,（3）洗涤和洗脱,2.7.4血清、血浆中高丰度蛋白的去除,蛋白质含量6