载体介绍PPT课件

.,1,载体介绍,.,2,什么是载体？,简单说，载体就是将外源DNA或基因携带入宿主细胞的工具。,.,3,载体应具备的特征,1.在宿主细胞内必须能够自主复制（具备复制原点）2.具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点，供外源DNA片断插入，同时不影响复制3.有一定的选择标记，用于筛选4.具有较高的拷贝数，便于载体的制备,.,4,载体分类,按功能分：克隆载体和表达载体按受体细胞类型分：原核载体，真核载体，穿梭载体按构建克隆载体的DNA来源分：质粒载体，噬菌体载体，cosmid克隆载体（柯斯质粒），噬菌粒载体，人工染色体载体等,.,5,质粒载体,包括：大肠杆菌质粒载体枯草杆菌质粒载体酵母质粒载体农杆菌质粒载体蓝细菌质粒载体（稍后以大肠杆菌质粒载体详细介绍）,.,6,噬菌体载体,双链DNA噬菌体载体：单链DNA噬菌体载体：M13，T3，T7,.,7,噬菌体载体,噬菌体颗粒中的DNA是一线性双链DNA分子，长48502bp，两端各有12个碱基的5凸出黏性末端是互补的。进入细胞的DNA通过两端的黏性末端环化。噬菌体上有些基因可被取代而不影响其生活周期。,.,8,.,9,噬菌体载体举例：gt10载体,.,10,噬菌体载体举例：EMBL3,.,11,噬菌体载体主要特点,主要有如下特点：(1)筛选简便；(2)可克隆的片段大，最大可达23kb，而质粒最大仅10kb左右；(3)转化效率高。,噬菌体载体是主要用于cDNA文库构建，也经常用于外源目的基因的克隆。,.,12,cosmid克隆载体,cosmid（cossite-carringplasmid）人工构建的含有DNA的cos（cohesive-endsite）位点序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。,.,13,柯斯质粒载体pHC79的形体图由pBR322质粒DNA与噬菌体DNA的cos位点及其控制包装作用的序列构成,1.具有噬菌体的特性：,cosmidvector的特点,克隆外源DNA后可以体外包装成噬菌体颗粒。,在寄主细胞内形成环化DNA（但不能形成新的噬菌体颗粒而溶菌）。,2.具有质粒载体的特性：,大多带有pMB1或ColE1的复制子，能象质粒一样复制。,.,15,有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位点。,3.方便的选择：,4.高容量的克隆能力：,45kb（最少不能低于30kb）。,.,16,噬菌粒载体（phagemidvector),由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型载体系列，称为噬菌粒（phagemid或phasmid）,.,17,几种常用的噬菌粒载体的一般特征,.,18,pUC119(MCS),pUC118(MCS),puC118和pUC119噬菌粒载体的分子结构,.,19,噬菌粒载体的优点,1.具小分子量的共价、闭合、环状的基因基因组DNA，可克隆高达10kb的外源DNA2.有ampr等基因作为选择记号3.拷贝数高4.存在多克隆位点,可克隆达10kb的外源DNA5.可用组织化学显色反应筛选重组子6.具质粒复制起点，在无辅助噬菌体存在下，克隆外源基因可按质粒一样复制7.有单链噬菌体复制起点，在有噬菌体辅助感染的宿主细胞中，可合成出单链DNA拷贝，并包装成噬菌体颗粒分泌到培养基中8.可直接对克隆的基因进行核苷酸测序,.,20,人工染色体载体（artificialchromosomevecter),定义：人工染色体载体又叫大分子DNA克隆载体，利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体。其装载外源DNA片段的容量可以与染色体的大小媲美。用来克隆大片段的DNA，不做常规克隆使用。分类：酵母人工染色体载体（YAC）细菌人工染色体载体（BAC）P1人工染色体载体（PAC）,.,21,酵母人工染色体载体（yeastartificialchromosome,YAC）,YAC的特点：,1.自主复制序列（ARS）（autonomousreplicatingsequence）DNA复制起始点（ori）,染色体复制和遗传的三个基本组件：,2.着丝粒（centromere，cen）,3.端粒（telomeres，tel）,.,23,YAC的组成结构,.,24,1.存在插入子的稳定性问题,YAC的缺点：,同一酵母细胞内多个YAC引起交换,2.转化效率低,3.难以制备纯的YAC-DNA,.,25,细菌人工染色体（BAC）,基于大肠杆菌F质粒构建的高容量低拷贝质粒载体。,克隆外源DNA片断：100-300kb,远大于柯斯质粒，但小于YAC,工作原理类似常规质粒克隆载体,比较稳定,每细胞只有一个拷贝，不会重组。,P1噬菌体载体和P1人工染色体载体,P1噬菌体：大肠杆菌的一种溶原性噬菌体。P1噬菌体载体工作原理类似黏粒载体外源片断70-100kbP1人工染色体载体P1噬菌体载体的改造，结合了P1噬菌体载体和BAC载体的优点。克隆外源片断130-150kb,.,27,（详细介绍）质粒载体,什么是质粒？质粒（plasmid）是独立于染色体外、具有自主复制能力的遗传单位，其本质是较小的核酸分子，大小范围在1kb-200kb以上不等。,.,28,1.很多细菌中已发现；2.是独立于细菌染色体之外的辅助性遗传单位，基因组绝大部分为双链环状DNA，不同质粒大小各异；大多数质粒的宿主范围较窄；4.已发展进化出多种机制以维持其在细菌宿主中的稳定的拷贝数；在不同的宿主细胞中拷贝数可能不同。5.复制转录的进行依赖于宿主编码的酶和蛋白质；6.常含有一些编码对细菌宿主有利的酶的基因。,细菌质粒的一般生物学特性,.,29,共价闭合环形DNA（CovalentclosecircularDNAcccDNA）,开环DNA（opencircular，ocDNA）,线性DNA（linear，lDNA）,环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型,.,30,质粒的命名,用小写字母p代表质粒（plasmid），在p字母后用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称，再加上质粒编号。如：pBR322：p表示一种质粒，而“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F.Bolivar和R.L.Rodriguez，322为编号。,.,31,质粒给宿主细胞的标记,1.氨苄青霉素(Ampicillin)2.卡那霉素(Kanamycin)3.四环素（Tetracycline）4.氯霉素(Chloramphenicol)5.链霉素（Streptomycin）6.潮霉素（Hygromycin）,.,32,质粒的复制类型,据质粒DNA复制与宿主之间的关系分为：1.“严紧型”复制控制的质粒(stringentplamid)：拷贝数少（1-5个）；2.“松弛型”复制控制的质粒(relaxedplasmid)：拷贝数多（10-200个）。,.,33,质粒DNA的转移,1.质粒的类型据能否自我转移可分为:接合型（conjugativeplasmid)非接合型（non-conjugativeplasmid)2.F质粒(fertilityfactor)F+又叫雄性决定因子，所以F+细胞又叫雄性细胞，相应的F又叫雌性细胞。F质粒(约94kb)在寄主细胞中有三种不同存在方式：F+FHfr。,.,34,基因工程中的质粒载体,克隆载体(cloningvector):使目的片段能在细菌细胞中复制的载体;表达载体（ExpressionVector）:使目的基因能在细菌细胞中表达为RNA或蛋白质的载体。穿梭载体（shuttlevector）：装有针对两种不同受体的复制子，便于基因克隆。这类载体可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。,.,35,一个合格质粒载体的组成要素,复制起始位点Ori即控制复制起始的位点：原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。抗生素抗性基因：可以便于加以检测，如Amp+，Kan+多克隆位点MCS：克隆携带外源基因片段P/E：启动子/增强子Terms：终止信号加poly（A）信号：可以起到稳定mRNA作用,.,36,如何阅读质粒图谱,第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。第三步：看多克隆位点（MCS）。看其限制性酶切位点，决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。第五步：是否含有表达系统元件，即启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号。,.,37,克隆载体必备条件,1.具有复制起点2.具有抗菌素抗性基因3.具有若干限制酶单一识别位点4.具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数,.,38,pSC1018.8kb拷贝数5、四环素抗性标记基因Ter,ColE16.5kb拷贝数2030、大肠杆菌内毒素标记基因E1,RSF2124ColE1衍生质粒、氨苄青霉素抗性标记基因Apr,目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的,.,39,pBR322载体,pBR322为4.36kb的环状双链DNA，其碱基序列已经全部清楚。是最早应用于基因工程的载体之一。把pBR322用限制性内切酶切去某片段，换上合用的表达组件，就可以构建成工作所需的新载体。许多实用的质粒载体都是在pBR322的基础上改建而成。可见其原型质粒在使用上有优点。,.,40,组成:,它由三部分组成：来自pSCl01的四环素抗性基因Tetr来自ColEl的衍生物pMBl的松弛复制起点ori来自RSF2124的氨苄青霉素抗性基因Ampr。,克隆载体1.pBR322,.,41,pBR322质粒载体的结构来源,Tetr,.,42,特点:,具有多个单一的限制性内切酶位点。,Tetr中有BamH1切点（GGATCC）和Sal切点（GAATTC），Ampr中有Pst切点（CTGCAG）。,利用ColEl的复制子，在细胞中是多拷贝的。,.,43,pBR322质粒载体的优点：具有较小的相对分子质量(4363bp)具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号(Ampr和Tetr)具有较高的拷贝数（15个,松弛型）,.,44,重组克隆的“插入失活”筛选方法,pBR322插入在Tetr中，基因型为Tets、Ampr在含有氨卞青霉素培养基上可生长，在含有四环素培养基上不生长；pBR322插入在Ampr中，基因型为Tetr、Amps、在含有氨卞青霉素培养基上不生长，在含有四环素培养基可生长；而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型。这种在一个基因位点中插入外源DNA片段，从而使该基因活性丧失的现象叫插入失活。,.,45,.,重组体的筛选,外源基因的插入：,.,.,46,2.pUC系列质粒载体,特点,具有更小的分子量（2686bp）和更高的拷贝数（500-700）。,具有多克隆位点,适于组织化学方法检测重组体,.,47,pUC18,pUC19,含四个部分：1.来自pBR322的质粒复制起点（ori）；2.ampr;3.大肠杆菌半乳糖苷酶基因（lacZ）的启动子及其编码-肽链的DNA序列；4.多克隆位点（MCS）,lacZ,Ori,Ampr,MCS,.,48,可用组化方法鉴别：,可通过插入失活法进行筛选,含有一个来自于大肠杆菌的经过加工的LacZ基因（LacZ），它编码-半乳糖苷酶氨基端146个氨基酸，可以和-半乳糖苷酶缺陷型的大肠杆菌实现基因内互补，即互补，恢复分解乳糖的能力。,X-gal也是-半乳糖苷酶的一种底物，经降解后可生成溴氯吲哚，使大肠杆菌菌落呈蓝色。当无-半乳糖苷酶时，X-gal不被分解，菌落呈白色。当外源基因插入到pUC质粒的LacZ基因内部，则LacZ基因受到破坏，便不能再和缺陷型受体菌中生成有活性的-半乳糖苷酶，因此，菌落呈白色。反之，非重组体为蓝色菌落。,含Ampr抗性基因，可通过插入失活和颜色反应进行双重筛选。,.,49,表达载体的必备条件,1.能自主复制2.具有方便、灵活的克隆位点和筛择标记3.具有能为RNA聚合酶识别的强大启动子4.启动子应可受诱导调控5.具有强终止子6.具有翻译起始信号,.,50,.,51,pGEX载体系统,.,52,.,53,pGEX-4T-1控制区,.,54,PET系统：大肠杆菌中蛋白表达的金字招牌,pET载体中，目标基因克隆到T7噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供T7RNA聚合酶来诱导表达。对于全世界许多研究者，Novagen的pET系统已成为在大肠杆菌中蛋白表达的首选。目前共包括36种载体类型、15种不同宿主菌。优点是原核蛋白表达引用最多的系统在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低真正的调节表达水平的“变阻器”控制提供各种不同融合标签和表达系统配置可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌,.,55,pET载体,pET载体以pBR322为基本骨架,但彼此间的先导序列、表达信号、融合标签、限制性酶切位点等有所不同。pET载体大致可分为两大类：转录载体和翻译载体。转录载体用以表达本身带有原核核糖体结合位点和AUG起始密码子的目的基因。只有3种转录载体：pET-21(+)、pET-24(+)和pET-23(+)。翻译载体包括来自T7噬菌体主要衣壳蛋白的高效核