微生物理论课件第六章 微生物生长

wugenfu,第六章Chapter6,微生物生长GrowthofMicrobes,wugenfu,微生物在适宜的环境条件下，不断地吸收周围环境中的营养物质，并按照自己的代谢方式进行代谢活动，如果同化作用大于异化作用，则细胞的原生质量不断增加，体积得以增大，这就是生长。生长就是有机体的细胞组分与结构在量方面的增加。,wugenfu,多细胞微生物的生长：（霉菌）（1）细胞的不断延长；（2）细胞数目的增加；通过形成无性孢子使个体数目增加叫繁殖。,wugenfu,单细胞微生物：（细菌和酵母菌）生长(Growth)表现为原生质与细胞结构在量上的增长。如果一个细胞分裂成二个，即细胞数目的增加，就叫繁殖(Reproduction)由生长到繁殖的过程（量变到质变的过程）就叫发育(Development)。,wugenfu,如果把微生物的整个培养系统作为一个整体来考虑，经过一定时间的培养后，细胞的总原生质量及总体积也不断地增长，我们把整个系统中微生物总原生质量及总体积的增长叫做群体增长。,微生物通过分裂使（个体）数目和质量增加的过程称为群体增长(populationgrowth)。,wugenfu,本章主要介绍,微生物的个体生长微生物的群体生长环境因子对微生物生长的影响。,wugenfu,第一节微生物的个体生长IndividualGrowthofMicroorganisms,同步化方法(synchronousmethod)单细胞微生物的个体生长多细胞微生物的个体生长,wugenfu,一、同步化细胞的取得,1.同步细胞(synchronouscells)：同步分裂或同步生长2.同步培养技术(synchronousculturetechnique):不得引起形态、结构、生理生化特性的改变1）选择法：同步细胞的体积大致相等A、过滤法B、离心法C、硝酸纤维滤膜法2）诱导法：用生理学手段强制同步A、化学诱导：饥饿-临分裂加营养-同步细胞B、物理诱导：物理环境-临分裂-恢复同步细胞。,同步化细胞只能维持2-3个世代,wugenfu,二、单细胞微生物的个体生长细胞壁细胞膜原生质DNA的生长与合成三、多细胞微生物的个体生长细胞的生长（伸长）细胞数目的增加。,wugenfu,第二节微生物的群体生长PopulationGrowthofMicroorganisms,研究方法-纯培养在实验室条件下从一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养(pureculture)。,一、纯培养的分离方法,wugenfu,1.dilutesample,1ml,9ml,10-110-210-310-410-510-610-7,cellno/ml,2.plateout0.1ml,（一）稀释法(serialdilation),Viablecellcount,wugenfu,Inoculatinganagarplatetoobtainsinglecolonies,（二)平皿划线分离(Streakplate),wugenfu,（三）单细胞挑取法(Pickingupsinglecell),用显微挑取器：样品悬液-稀释-置于湿室内-显微镜下观察到单个细胞-用显微挑取器的毛细管吸取单细胞-培养基上培养-纯培养。,wugenfu,二群体生长的测定,微生物通过分裂使群体数目和质量增加的过程。群体生长的测定可分为（一）数量法:生长量与微生物个体数目成正比，即微生物的数目代表了生长量(二)重量法,wugenfu,1、显微镜直接计数法,优点：快速、简便缺点：无法分清死活细胞（全菌计数法），精确度差。此方法只适用于单细胞，非丝状微生物的计数。,wugenfu,2、平板计数法（活菌计数法）,优点：计数的为活菌，精确度较高。缺点：烦琐、费时。只能测定单细胞，单孢子对浓度低的样品可先用滤膜培养法,wugenfu,3、比浊法,优点：快速、简便缺点：全菌、误差大。适用；浓度较高，无其他杂菌的微生物培养液。,wugenfu,应用统计学原理来计数,4、液体稀释法(MPN)Mostprobablynumbermethod,9管法（3个重复,15管法（5个重复）,10-2,10-3,10-4,wugenfu,（二）重量法,1、称重法：培养液-过滤（或离心）-洗涤去杂质-称湿重或干重。2、测定总含氮量用凯氏定氮法测定含氮百分率蛋白质含量=含氮量%*6.25,wugenfu,3、测定DNA含量DNA能与一定的试剂（如DAPA，4，6-二联脒-2-吲哚苯；或溴化乙锭）发生荧光反应，荧光强弱与DNA含量成正比，可根据标准曲线求出DNA含量(每个细菌的DNA平均含量为8.4*10-5纳克)。4、测定其他生理指标的含量如氧气的吸收量，CO2的产生量，发酵糖后的产酸量来推知细菌的生长情况。对于丝状微生物，一般是测定菌丝的长度或称取菌丝的重量作为生长指标,wugenfu,三、分批培养时细菌纯培养的群体生长规律,以培养时间为横坐标，以(活)菌数的对数为纵坐标作图，可以得到一个曲线-单细胞微生物的繁殖曲线，或单细胞微生物群体生长曲线(GrowthCurve)。根据细菌在不同时期的生长速率不同，可将曲线大致分为四个阶段。,将微生物置于一定容积的培养基中，经过生长繁殖，最后一次收获，这种培养方式称为分批培养（Batchculture),wugenfu,生长曲线描述细菌生长规律,活菌数,培养时间,.指数期,.稳定期,.衰亡期,.延滞期,细菌数目（个/ml）对数,培养时间,wugenfu,（一）延迟期(LagPhase),1、出现原因：适应新的环境。调整代谢，重新合成必需量的酶、辅酶或某些中间代谢产物。2、特点：（1）生长速率=0，但细胞体积增大。如巨大芽孢杆菌：0小时：3.4微米；3.5小时：9.1微米；5.5小时，19.8微米。（2）代谢旺盛，容易产生各种诱导酶；（3）对外界理化因子敏感，对不良条件抵抗力差。,wugenfu,3、影响对工业生产不利，使生产周期延长，设备利用率下降。4、缩短延迟期的措施（1）增大接种量（2）用对数期菌种接种（3）选用繁殖快的菌种（4）在种子培养基中加入发酵培养基的某些成分.,wugenfu,（二）对数生长期(LogPhase),1、出现原因：（1）菌体已经完成了适应过程（2）培养基内的养料还很丰富（3）有害代谢产物尚未积累（4）培养条件比较适宜,wugenfu,2、特点（1）繁殖最快，菌体以几何级数增加；（2）菌体健壮，代谢活跃，形态整齐，活性一致；（3）细菌数目的增加与菌液浊度成正比。世代时间g=t/n=(t1-tO)*lg2/(lgNt-lgNO)生长速率(growthrate)，即每小时分裂代数=1/g3、应用（1）发酵生产的良好种子（2）研究基本代谢的良好材料（3）微生物育种的好材料,wugenfu,（三）稳定期（StationaryPhase),1、出现原因：（1）营养物质消耗（2）有害代谢产物的积累（3）环境条件的变化2、特点（1）新增细胞数=死亡的细胞数，生长速度=0（2）活细胞总数达最高，菌体产量达最高点。（3）储藏物或代谢产物大量积累。,wugenfu,生长产量常数Y（生长得率growthyield）Y=(X-X0)/(C0-C)X：稳定期的细胞干重X0：刚接种时的细胞干重C0：限制性营养物质初浓度C：限制性营养物质终浓度3、应用（1）是收获菌体的好时机（2）工业生产上收获产物的高峰期,wugenfu,（四）衰亡期DeathPhase,1、出现原因营养物质进一步消耗，有害代谢产物进一步积累，环境更加不利。2、特点（1）死亡速率生长速率，活菌数下降；（2）细胞大小、形态不一，有时产生畸形，有时G+变成G-反应3、应用由于芽孢与孢子多在此期形成，所以多用此期的前期菌体或孢子作为菌种保藏；,wugenfu,活菌数,培养时间,.延滞期,培养时间,四、连续培养ContinuousCulture,不断流加营养物质，并以同样速度排出培养物，使对数生长期长期保持,wugenfu,连续培养就是在培养液中不断流加新鲜营养物质，并及时不断地以同样速度排出培养物（包括菌体及代谢产物），使微生物一直以对数生长速度生长的培养方法。连续培养方法一般分为两大类：恒浊连续培养恒化连续培养,wugenfu,（一）恒浊连续培养-恒浊器（Turbidostat),不断调节流速，使培养液的浊度保持恒定.如果所有必需营养物都过量，就可使菌体维持最高生长速率。常用此法来得到大量菌体及与之相平行的代谢产物。,wugenfu,（二）恒化连续培养-恒化器（Chemostat）,控制恒定流速，使耗去的营养物质得到补充，培养室中营养物浓度保持恒定，从而使生长速度恒定。又称恒组成培养。一般将某种营养物质作为限制性因子，细菌的生长速率取决于限制性因子的量。用不同浓度的限制性营养物进行恒化连续培养，可以得到不同生长速率的培养物。多用于微生物学的研究。,wugenfu,连续培养(continuousculture)(openculture),缺点：菌种易退化；易染杂菌,wugenfu,连续培养法用到工业发酵中就称连续发酵（Continuousfermentation)优点：（1）缩短发酵周期，提高设备利用率（2）便于自动控制，降低劳动力及动力消耗（3）产品较均一缺点：易污染，菌种易退化。,wugenfu,发酵：有氧发酵，无氧发酵发酵：固态发酵、液态发酵发酵：细菌发酵、放线菌发酵、酵母菌发酵、霉菌发酵发酵工程发酵工程实验（技能训练）暑假选修课（短学期）07188110,wugenfu,第三节微生物生长的调节和控制,微生物生长与环境有着密切的联系环境对微生物的影响大致可分为三种情况1、适宜的环境：2、不适宜的环境（1）抑制微生物的生长发育（2）改变微生物原有的特性3、恶劣的环境：,wugenfu,适宜的环境,不适宜的环境,恶劣的环境,得到微生物菌体及代谢产物,促进微生物的生长,防腐保藏菌种,抑制微生物的生长发育,诱变育种,改变微生物原有的特性,使微生物死亡,灭菌消毒,wugenfu,是一种防止或抑制微生物生长的方法。即利用某些理化因子使微生物暂时处于不生长、不繁殖但又未完全死亡的状态。是一种防止食品腐败和其他物质霉变的技术措施。如低温、干燥、盐腌、糖渍等（保鲜,防霉）,杀灭物体上所有微生物的方法。通过灭菌后，物品上不存在任何有生命的有机体。,3、灭菌(Sterilization),杀灭物体上病原微生物的方法。可达到防止传染病传染的目的。如巴斯德消毒、煮沸消毒等。,2、消毒(Disinfection),1、防腐(Asepsis),wugenfu,在研究理化因子与微生物的关系时，还应注意：（1)不同微生物对各种理化因子的敏感性不同（2)同一理化因子的不同剂量对微生物的效应不同（3)微生物的生理状态会影响理化因子的作用,wugenfu,最适生长温度：指微生物生长繁殖最快的温度；最低生长温度：指微生物能进行生长繁殖的最低温度，低于此温度，停止生长；最高生长温度：指微生物能进行繁殖的最高温度，高于此温度，细胞死亡；,一、温度(Temperature),在温度低于最适生长温度时，随着温度的上升，细胞生化反应速率和生长速率加快。当温度升高到一定值时，蛋白质、核酸遭到破坏。,wugenfu,根据对温度需求的不同，把微生物分为三大类型：,wugenfu,（一）低温对微生物的影响,1、低温对低温型微生物的影响很小:(1）细胞内的酶在低温下仍能有效地发挥作用（2）细胞膜中不饱和脂肪酸的含量高，在低温下仍能保持半流动性。2、低温可抑制中、高温型微生物的生长繁殖，使微生物处于休眠状态,wugenfu,3、低于冰点的温度对微生物有致死作用（1）冰晶破坏了原生质胶体状态，细胞脱水（2）冰晶造成细胞，尤其膜的物理损伤。防止方法（1）快速冷冻：水冻成均匀的玻璃状或是透明不定形的物质（2）加入保护剂，如甘油、血清、牛奶等。4、应用食品冷藏菌种保藏,wugenfu,(二)高温对微生物生长的影响,1、高温对高温型微生物的生长影响很小（1）酶和蛋白质的抗热性强；（2）饱和脂肪酸含量高,直链脂肪酸多，保持半流动性；（3）核糖体对高温有较大的抗性；（4）核酸中G+C比例高；（5）能产生多胺、热亚胺和高温精胺等保护分子；（6）生长速率快，合成迅速，以弥补破坏的大分子。2、高于最高生长温度的高温能杀死微生物(1）原生质胶体状态破坏，膜被热溶解，半流动性丧失（2）酶失活，蛋白质、核酸产生不可逆变性,wugenfu,3、对高温的利用,高温能杀死微生物，广泛应用于消毒灭菌：（1）干热灭菌（2）湿热灭菌在一定温度和其他条件下，杀死微生物所需的最短时间称为致死时间；在一定时间和其他条件下，杀死微生物的最低温度称为致死温度。,wugenfu,（1）干热灭菌,A、焚烧灭菌法：灭菌彻底、迅速、简便，使用范围有限，常用于接种工具、污染物品等处理；B、干热灭菌法：可保持物品的干燥。适用范围：玻璃器皿、金属用具等耐热物品。,wugenfu,（2）湿热灭菌,蒸汽的穿透力大；蛋白质在含水的情况下更容易凝固；蒸汽有潜热（汽化热）存在,提高灭菌物体的温度。常用的湿热灭菌方法A、高压蒸汽灭菌法B、间隙灭菌法C、煮沸消毒法D、巴氏消毒法:62-6330分钟或71-7215分钟。杀死病原菌，又不损害营养与风味。结核杆菌的致死温度为6215分钟。,wugenfu,（三）适温对微生物的影响,有许多微生物的最适生长温度与产物形成的最适温度是不同的。所以，发酵前期控制温度使其生长，后期控制在形成产物的最适温度。如青霉素发酵：,wugenfu,接种后30,5小时,至25,35小时,85小时,至25,至20,40小时,有利菌丝生长,使发酵速度加快,青霉素大量合成,营养物完全利用,青霉素发酵工艺：,wugenfu,二、干燥（Drying)或水活度(aw),作用：抑制微生物的生长，严重时使微生物死亡。机理：影响酶的活性，使代谢不能正常进行，细胞处于失水状态；严重时细胞脱水、蛋白质变性。用途：(1)可抑制或致死微生物-保存食品(2)休眠孢子抗干燥能力强-可用于菌种保藏。,wugenfu,水几类微生物生长的最适aw,wugenfu,三、渗透压(Osmolarity),是溶剂透过半透膜时的压力细胞只能在一定的渗透压范围内生活。高渗下：细胞失水,质壁分离;抑菌，甚至死亡；低渗下:细胞膨胀，甚至破裂死亡。用途：（1）高糖、高盐保存食品（2）低渗使细胞破裂-细胞膜、细胞器制备；耐高渗的菌种能进行高糖发酵。,wugenfu,四、氢离子浓度（pH）,1、氢离子浓度对微生物的影响（1）影响微生物生长：最适生长pH。生长能改变pH，培养基中要加缓冲物质；（2）影响代谢产物合成培养基的pH不同，可积累不同的代谢产物。如酵母菌pH4.5时为乙醇发酵，pH8时产生乙醇、甘油。（）强酸、强碱可杀菌。腐蚀性大，一般不作消毒剂。某些酸可防腐、防霉。如苯甲酸可作防腐剂，丙酸可防霉，乳酸可抑制腐败性微生物的生长。,wugenfu,、氢离子浓度影响微生物生长的机理（1）引起膜电荷的变化，影响对营养的吸收；（2）影响代谢过程中酶的活性；(3)改变营养物质的可给性及有害物质的毒性。、应用（1）控制pH，使生长最适宜;有利于代谢产物的形成；有利于有益微生物的生长，控制杂菌。（2）杀菌，防腐（3）保存食品（乳酸菌）,wugenfu,五、氧气（Oxygen),1、根据对氧气的需求不同，可分为（1）专性好氧微生物：（2）专性厌氧微生物：(3)兼性厌氧微生物：（4）耐氧性厌氧微生物：只有超氧化物歧化酶，而不具接触酶，产生的过氧化氢通过细胞内某些还原性物质的氧化而解毒。(5)微需氧微生物：在通气和绝对厌氧下均不能生长，只有在氧气浓度0.2大气压时才能生长。,wugenfu,、氧气的作用机理（1）影响酶的活性（2）影响细胞的呼吸作用、应用对好氧性微生物，缺氧能抑制其生长，故可用于保藏菌种,wugenfu,六、辐射（Radiation),波长越长，所含能量越低，生物学效应最弱。,wugenfu,UV杀菌机理A、形成嘧啶二聚体，T=T，干扰核酸复制；B、可使O2O3，O3O2+O。注意A、穿透力弱，只适于空气及表面消毒；B、紫外照射后不能暴露于可见光中，因为有光复活作用。,wugenfu,射线杀菌机理：A、直接学说（靶子学说）认为能量直接作用于细胞某个特殊的敏感区，导致细胞死亡；B、间接学说：辐射引起电离，生成的自由基使细胞中的敏感分子发生反应，使后者失活。电离辐射，穿透力强，能致死所有微生物,wugenfu,七、重金属及其化合物,1、作用：某些是细胞组分，低浓度促生长，高浓度有毒；某些重金属离子不管浓度大小，对生长有抑制或致死作用。、作用机制（1）与蛋白质结合使其变性（蛋白质带负电，重金属带正电）（）与酶上的SH结合使酶失活、应用有效的杀菌或防腐剂，如HgCl2(升汞)，红汞（汞溴红）1%硝酸银滴入新生儿眼内，防止传染性眼炎；CuSO4与石灰配成的波尔多液能杀真菌。砷、铋、锑等用作化学疗剂治疗梅毒及原生动物引起的疾病。,wugenfu,八、有机化合物,1、作用（1）使蛋白质变性（2）破坏细胞膜的透性，使细胞内含物外溢；2、机理（1）破坏了蛋白质高级结构中的氢键、疏水键等，如甲醛能与-NH2结合；（）有的有机化合物具有表面活性剂的作用，破坏膜的透性（有机溶剂）,wugenfu,、应用,（1）是常用的消毒剂:0.5%的酚（石炭酸）为防腐剂，2-5%的酚为消毒剂；70%乙醇（酒精棉）消毒皮肤，10%的甲醛消毒厂房、无菌室等（每立方米用10mL福尔马林）；（2）酚系数是评价消毒剂杀菌能力的标志：将某一消毒剂作不同梯度的稀释，在一定时间内（10分钟），一定条件下致死全部供试微生物的最高稀释度与达到同样效果的酚的最高稀释度的比值，即为酚系数。酚系数越大，表明该消毒剂的杀菌能力越强。,wugenfu,消毒剂杀菌能力的测定,待测消毒剂的酚系数.,wugenfu,九、氧化剂,1、作用：使蛋白质变性，酶失活-抑菌杀菌作用；2、机理：产生自由基；使蛋白质中的-SH氧化成-S-S-；3、应用：0.1-1%的KMnO4消毒皮肤；3%H2O2（双氧水）消毒感染的伤口；过氧乙酸对肝炎病毒有特效；碘酒是皮肤及小伤口的有效消毒剂；0.2-0.5ppm的Cl2消毒自来水和游泳池；5-20%的次氯酸钙（漂白粉）常用作餐具的消毒。,wugenfu,十、染料,1、作用：低浓度抑菌，高浓度杀菌2、机理：与蛋白质进行离子交换，使蛋白质失去活性，所以碱性染料效果好。3、应用：如龙胆紫（紫药水），2-4%作外用药水。,wugenfu,第四节化学疗剂与微生物的生长,一、化学疗剂对微生物生长的影响二、微生物对化学疗剂的适应,wugenfu,一、化学疗剂对微生物生长的影响,化学疗剂(ChemotherapeuticAgents):能直接干扰病原微生物的生长繁殖，并可用于治疗感染性疾病的化学药剂抗代谢物抗生素,wugenfu,（一）抗代谢物(Anti-metabolite),结构上与生物体所必需的代谢物很相似，能和特定的酶结合，从而阻碍酶的功能，干扰代谢正常进行的物质。即能与正常代谢物产生竞争性拮抗作用的物质。如百浪多息(prontosil),wugenfu,磺胺药(sulphonamides,sulfadrugs)抑菌机理,TMP:三甲基苄二氨嘧啶(磺胺增效剂),选择素力,是氨基苯磺酰胺的衍生物，与对氨基苯甲酸很相似，能与二氢甲酸合成酶结合，从而阻断了叶酸的合成，使氨基酸、维生素的合成缺乏了必需的辅酶，细菌细胞的活力受到明显的破坏。而哺乳动物必须依靠现成的叶酸生活，所以不影响人和动物的代谢。,wugenfu,叶酸是一种重要的辅酶，用于氨基酸，维生素的合成,wugenfu,（二）抗生素（Antibiotics),原认为：抗生素指来源于微生物，在微量情况下就能发挥抗其他微生物活性的化学物质。抗生素是生物在其生命活动中产生的一种次生代谢产物，或是一种与之相类似的物质（