食品微生物学-遗传变异和育种PPT课件

微生物遗传变异和育种,.,2,证明遗传物质基础的三个经典实验微生物的基因组、质粒的特点和类型微生物基因突变及其机制。微生物的基因重组微生物菌种选育微生物菌种衰退、复壮和保藏,本章内容,.,3,遗传（heredity）：指生物的上一代将自己的一整套遗传因子传递给下一代的行为和功能。遗传型（genotype）：又称基因型，指某一生物个体所含有的全部遗传因子即基因组所携带的遗传信息。表型（phenotype）:指某一生物所具有的一切外表特征和内在特性的总和,是遗传型在合适条件下的具体表现。,*几个概念,.,4,变异（variation）：亲子之间或子代个体之间性状表现的差异称为变异。变异分不遗传的变异和可遗传的变异。遗传变异：由于遗传物质的改变所致的变异。遗传物质的改变方式有基因突变、基因重组、原生质体融合等。饰变：即不遗传的变异指不涉及遗传物质结构而只发生在转录、翻译水平上的表型变化。,.,5,植物蛋白水解培养基,糖盐培养基粘液型菌落,放射型土壤杆菌,非粘液型菌落,.,6,胰蛋白胨培养基,脑心浸液培养基,诺卡氏菌,.,7,球形节杆菌,完全培养基,生物素缺陷培养基,.,8,*微生物的遗传变异的特点,1、大多数微生物为单细胞构造简单，通常为单倍体，而且直接接触外界环境，任何条件的变化，都可影响微生物，从而降低了遗传的保守性。2、繁殖速度快，可在短时间重复多次，即使变异的频率十分低，也可在短时间内产生大量的变异后代。,.,9,3、常见的变异形式是基因突变,它可以涉及到任何性状:形态构造、代谢途径、生理类型等。4、大多数微生物为无性繁殖,一旦发生变异很容易在性状上表现和保留出来,有利于筛选好的特性。,.,10,第一节遗传变异的物质基础,一、证明遗传物质的三个经典实验,经典转化实验,噬菌体感染实验,病毒重建实验,.,11,1、经典转化实验,肺炎双球菌（有荚膜）,研究对象：肺炎双球菌S型菌株：有荚膜，菌落表面光滑，有致病性R型菌株：无荚膜，菌落表面粗糙，无致病性,.,12,Griffith,.,13,.,14,.,15,2、噬菌体感染实验,Hershey真核微生物，多条染色体，例如啤酒酵母有16条染色体。有时为双倍体,.,21,一、微生物染色体基因组结构的特点,1、原核生物（细菌、古生菌）的基因组,1）染色体为双链环状的DNA分子（单倍体）；,双链环状的染色体在细胞中以紧密缠绕成的较致密的不规则小体形式存在于细胞中，该小体称为拟核(nucliod)，其上结合有类组蛋白蛋白质和少量RNA分子。,例外：布氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)的染色体是线状的,.,22,个别细菌(鼠伤寒沙门氏菌和犬螺杆菌)和古生菌的rRNA和tRNA中也发现有内含子或间插序列,2）基因组上遗传信息具有连续性；,一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的。,.,23,3）功能相关的结构基因组成操纵子结构；,4）结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝；,5）基因组的重复序列少而短；,古生菌的基因组在结构上类似于细菌。但是信息传递系统(复制、转录和翻译)则与细菌不同而类似于真核生物。,操纵子（operon）：功能相关的几个基因前后相连，再加上一个共同的调节基因和一组共同的控制位点（启动子、操作子等）在基因转录时协同动作。,.,24,.,25,.,26,2、真核微生物（啤酒酵母）的基因组,1）典型的真核染色体结构；,2）没有明显的操纵子结构；,3）有间隔区（即非编码区）和内含子序列；,4）重复序列多；,.,27,二、质粒,质粒（plasmid）：一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。,.,28,1、质粒的分子结构,通常以共价闭合环状(covalentlyclosedcircle，简称CCC)的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；,也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒；,质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb；（细菌质粒多在10kb以内）,.,29,.,30,2、质粒的特点,非必需，体积小，多拷贝，自我复制，可转移，可重组，不亲和。,.,31,.,32,3、质粒的主要类型,致育因子（Fertilityfactor，F因子）抗性因子（Resistancefactor，R因子）产细菌素的质粒（Bacteriocinproductionplasmid）毒性质粒（virulenceplasmid）代谢质粒（Metabolicplasmid）隐秘质粒（crypticplasmid）,.,33,致育因子,又称F质粒，其大小约100kb，这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象（接合作用）有关的质粒。,携带F质粒的菌株称为F+菌株（相当于雄性），无F质粒的菌株称为F-菌株（相当于雌性）。,.,34,F因子能以游离状态(F+)和以与染色体相结合的状态(Hfr)存在于细胞中，所以又称之为附加体episome)。,.,35,抗性因子,包括抗药性和抗重金属二大类，简称R质粒。,.,36,R100质粒(89kb)可使宿主对下列药物及重金属具有抗性：汞、磺胺、链霉素、夫西地酸、氯霉素、四环素、并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于抗性质粒上。,.,37,产细菌素的质粒,.,38,大肠杆菌（E.coli）产生的细菌素为colicins（大肠杆菌素），而质粒被称为Col质粒。,一种乳酸细菌产生的细菌素NisinA能强烈抑制某些G+细菌的生长，而被用于食品工业的保藏。,.,39,毒性质粒,许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的，这些质粒具有编码毒素的基因，其产物对宿主（动物、植物）造成伤害。,产毒素大肠杆菌是引起人类和动物腹泻的主要病原菌之一，其中许多菌株含有为一种或多种肠毒素编码的质粒.苏云金杆菌含有编码内毒素(伴孢晶体中)的质粒.根癌土壤杆菌所含Ti质粒是引起双子叶植物冠瘿瘤的致病因子.,.,40,代谢质粒,质粒上携带有有利于微生物生存的基因，如能降解某些基质的酶，进行共生固氮，或产生抗生素（某些放线菌）等。,假单胞菌：具有降解一些有毒化合物，如芳香簇化合物(苯)、农药、辛烷和樟脑等的能力。,降解质粒：将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式，环境保护方面具有重要的意义。,.,41,隐秘质粒,隐秘质粒不显示任何表型效应，它们的存在只有通过物理的方法，例如用凝胶电泳检测细胞抽提液等方法才能发现。它们存在的生物学意义，目前几乎不了解。,在应用上，很多隐秘质粒被加以改造作为基因工程的载体。,.,42,一、微生物的基因突变,基因突变：简称突变，是指细胞内（或病毒粒子内）遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化。从自然界分离的菌株称野生型，突变后的菌株称突变型（株）。,第三节微生物基因突变,狭义的基因突变（点突变）：只涉及DNA分子一对碱基或少数几对碱基的变化。广义：包括染色体畸变和基因突变。,.,43,1、根据DNA变化的范围分,基因突变,置换,移码突变（缺失或添加）,染色体畸变,染色体结构改变,染色体数目改变,转换,颠换,缺失重复倒位易位,整倍性改变,非整倍性改变,（一）突变类型,.,44,（1）碱基置换：一对碱基被另一对碱基所置换转换：从一种嘌呤变到另一嘌呤或从一种嘧啶到另一嘧啶，可称为转换；颠换：从嘌呤到嘧啶（A-C或G-T等）或从嘧啶到嘌呤（C-G，T-A等），则称它为颠换。,（2）移码突变：DNA分子中一对或少数几对核苷酸增加或缺失而造成的基因突变。,.,45,（3）染色体畸变:某些因素使DNA发生大的损伤，使染色体产生畸变，结构上出现缺失、重复、倒位和易位的现象，数目上有所增减。,.,46,.,47,DNA复制中的碱基配对错误,自发损伤,脱嘌呤,脱氨基,氧化性损伤碱基,可转移遗传因子的作用,自发突变,碱基类似物,烷化剂,嵌合剂,辐射,黄曲霉毒素,诱发突变,2、根据突变起因分,.,48,自发突变：指生物体在无人工干预下自然发生的低频率突变。诱发突变：指通过人为的方法，利用物理、化学或生物因素显著提高基因自发突变频率，从而达到遗传性状的改变。,.,49,营养缺陷型,抗性突变型,条件致死突变型,形态突变型,抗原突变型,产量突变型,选择型突变,非选择型突变,3、根据表型分,选择型突变：凡能用选择性培养基（或其他选择性培养条件）快速选择出来的突变株。,致死突变型和半致死突变型,.,50,营养缺陷型：丧失某种物质合成能力，无法在基础培养基上生长。抗性突变型：对化学药物或致死物理因子产生抗性条件致死突变型：某条件能正常生长，另一条件却不能。如Ts突变株。,.,51,形态突变型:个体或菌落形态发生变异抗原突变型:细胞抗原结构发生变异，如荚膜成分产量突变型:代谢产物产量变异,高正T,低负T致死突变型和半致死突变型：由于基因突变而造成个体死亡的突变类型为致死突变型。造成个体生活力下降的的突变型为半致死突变型。,.,52,正向突变,回复突变,4、根据突变方向分,正向突变：野生型基因可以通过突变成为突变型基因。回复突变：突变型基因会再次发生突变而成为野生型基因,.,53,1.自发性:有三个实验证明2.不对应性(性状与原因）3.稀有性；4.独立性；5.可诱变性；6.稳定性；7.可逆性。,（二）基因突变的特点,.,54,某一细胞（或病毒粒子）在每一世代中发生某一性状突变的几率，称突变率。,突变率,.,55,Luria等的变量试验,T1,103,103,0.2ml,相差很大,相差不大,.,56,Newcombe的涂布试验,.,57,Lederberg等的影印平板培养法,.,58,影印法分离缺陷型菌株,.,59,.,60,1自发突变机制,（1）多因素低剂量的诱变效应；（2）互变异构效应,（三）基因突变机制,.,61,在自然环境中存在着低剂量的宇宙射线、各种短波辐射、低剂量的诱变物质和微生物自身代谢产生的诱变物质等的作用引起的突变。,多因素低剂量的诱变效应,.,62,四种碱基第六位上的酮基或氨基的瞬间变构，会引起碱基的错配。T和G可以酮式或稀醇式出现，C和A可以氨基式或亚氨基式出现。平衡是倾向于酮式或氨基式的，因此，DNA双链中以AT和GC碱基配对为主。,互变异构效应,.,63,.,64,诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质。常用的诱变剂包括物理、化学和生物的三大类。,2、诱发突变机制,.,65,紫外线、快中子、X射线、射线、射线、激光物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。,物理诱变剂,.,66,DNA对紫外线有强烈的吸收，在碱基中嘧啶（T，C）比嘌呤（A，G）更敏感。紫外线的作用机制是主要形成胸腺嘧啶二聚体，以改变DNA生物活性，造成菌体死亡和变异。,紫外线的作用原理,.,67,把经UV照射后的M立即暴露于可见光下时，死亡率明显降低的现象。,光复活作用,.,68,切除修复不依赖于可见光，只通过酶切去除嘧啶二聚体，随后重新合成一段正常DNA链的核酸修复方式。重组修复SOS修复,核酸内切酶,核酸外切酶,.,69,碱基类似物2-氨基嘌呤、5-溴尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤原理：在结构上和目标物类似，可以被用于DNA合成，但配对时和原有碱基表现出差异。如5-溴尿嘧啶（5-BU）是胸腺嘧啶（T）的类似物，BU（酮式）-A，BU（稀醇式）-G,化学诱变剂,.,70,.,71,与碱基反应的物质,烷化剂（如亚硝基胍强致癌物）原理：诱变剂中含有一个或多个活性烷基，使碱基烷化。如鸟嘌呤烷基化后，稀醇式为主要存在形式。GCG*TAT,脱氨基诱变剂（如亚硝酸）原理：使碱基脱氨基。如A脱氨基H（次黄嘌呤）只能和C配对，ATHCGC,.,72,原理：插入DNA双螺旋相邻的碱基对之间，引起DNA分子插入或缺失一个或几个碱基，造成遗传密码转录和翻译的错误。,移码诱变剂,丫啶类物质、丫啶氮芥衍生物,.,73,.,74,吖啶类染料（吖啶橙等）和称为ICR的物质都是有效的移码突变诱变剂。细菌:ICR191有效；酵母菌:溴化乙锭有效噬菌体:吖啶橙和5-氨基吖啶有效；,.,75,第四节微生物基因重组,基因重组（遗传传递）：指遗传物质从一个微生物细胞向另一个微生物细胞传递，形成新的遗传型个体的过程。原核生物基因重组：转化、转导、接合和原生质体融合真核生物基因重组：有性杂交.准性杂交.原生质体融合,.,76,一、原核微生物的基因重组,（一）转化（transformation）,受体菌直接吸收供体菌的DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象。转化因子：供体菌DNA片段。转化子：转化后的受体菌。,1、转化,.,77,2、转化的特点,1）转化一般只发生在同一物种或近缘物种之间。2）受体细胞只有处于感受态阶段才能吸收供体的DNA。感受态：指受体细胞最易接收外源DNA片段并能实现转化的一种生理状态。,.,78,3、转化过程,a、供体DNA片段和处于感受态受体细胞表面的膜连DNA结合蛋白相结合，其中一条链被核酸酶水解，另一条进入细胞。b、在同源区内发生基因重组c、受体DNA复制，杂合区也得到复制。d、细胞分裂后，形成一个转化子和一个仍保持受体原来基因型的子代。,.,79,转化过程示意图,.,80,转染：用提纯的病毒核酸（RNA或DNA）去感染其宿主细胞或原生质体，可增殖出一群正常病毒后代的现象。,.,81,（二）转导（transductlo）,通过噬菌体为媒介，将供体菌细胞的小片段DNA携带到受体细胞中，通过交换和整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象。,1、概念,通过转导而获得新遗传性状的受体细胞称为转导子。,.,82,2、类型,普遍转导,特异（局限）转导,转导,高频转导,低频转导,完全转导,流产转导,.,83,概念：转导噬菌体可以转导供体染色体的任何部分到受体细胞中的转导过程。分完全普遍转导和流产普遍转导两种,（1）普遍转导,.,84,.,85,普遍性转导的三种后果：,形成稳定的转导子，完全转导,流产转导,外源DNA被降解,.,86,流产转导特征,特点：在选择培养基平板上形成微小菌落,.,87,外源DNA在供体内既不交换、整合和复制，也不迅速消失，仅表现稳定的转录、翻译和表达。,少量酶,流产转导形成微小菌落的原因,.,88,由于供体菌的片段没有重组到受体的染色体上，它本身不具有独立复制的能力，随着细胞的分裂，供体片段只能沿着单个细胞传递下去，只有保留了供体DNA片段的子细胞才能合成供体片段所编码的酶，而没有得到供体DNA片段的子细胞不能合成新酶，但仍含有非常有限的由母细胞分裂时残留的酶，只够完成少数几次细胞分裂所用，所以形成的是微小的菌落。,.,89,（2）局限性转导,概念：部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体中，并获得表达的转导现象。,.,90,温和噬菌体感染,整合到细菌染色体上的特定位点,溶源菌发生裂解时，在原噬菌体二侧的少数宿主基因因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体DNA上,部分缺陷的温和噬菌体,把供体菌的特定基因转移到受体菌,过程原理,.,91,温和噬菌体裂解时的不正常切割：包含gal或bio基因（几率一般仅有10-6）,.,92,缺陷噬菌体在宿主细胞内能够象正常的DNA分子一样进行复制、包装，提供所需要的裂解功能，形成转导颗粒。但没有正常噬菌体的增殖能力，感染受体细胞后，通过DNA整合进宿主染色体而形成稳定的转导子。,.,93,通过一般溶源菌释放的噬菌体所进行的转导。,因为这种转导因为原噬菌体从宿主细胞染色体上脱离下来时，因误切而形成缺陷型噬菌体的频率只有10-4-10-6。,低频转导,.,94,对双重溶源菌诱导,就会产生含50左右高频转导裂解物,用此转导受体菌,获得50转导子。,双重溶源菌：同时感染有正常噬菌体和缺陷噬菌体的受体菌,dgal,高频转导,.,95,普遍性转导,局限性转导,（3）区别普遍转导和局限性转导,.,96,普通性转导和局限性转导比较,.,97,（三）接合,概念：供体菌（“雄性”）通过性菌毛与受体菌（“雌性”）直接接触，把F质粒传递给后者，使后者获得若干新遗传性状的现象。,通过接合而获得新遗传性状的受体细胞称为接合子。,.,98,大肠杆菌F质粒基因图,内圈数字表示质粒的大小和关健基因所处的位置：tra,转移功能；oriT,转移起始点，oris，复制起始点，inc,不相容性基因，rep，复制功能基因,.,99,F质粒通过接合作用进行转移,.,100,接合作用的特点,1）需要供体菌和受体菌的直接接触，才能进行重组。2）接合作用是一种低级的有性生殖方式。3）能发生接合作用的细菌大多数是革兰氏阴性菌。4）接合作用是在被称为雄性菌株和雌性菌株之间进行的5）接合作用相关基因位于F因子,.,101,.,102,F因子的四种细胞形式,a）F-菌株，不含F因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收F因子而变成雄性菌株（F+）；,b）F+菌株，F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。,c）Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。,d）F菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F因子。细胞表面同样有性菌毛。,.,103,F质粒的四种存在方式及其相互关系,.,104,1）F+F-,结果：给体细胞和受体细胞均成为F+细胞,F+菌株的F因子向F-细胞转移，但含F因子的宿主细胞的染色体DNA一般不被转移。,3种雄性菌株与雌性菌株接合结果,.,105,Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上，因此只要发生接合转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株。,2）HfrF-,.,106,染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会就越多，在F-中出现重组子的的时间就越早，频率也高。,.,107,Hfr菌株仍然保持着F+细胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一样与F-细胞进行接合。所不同的是，当OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，F因子的先导区(leadingregion)结合着染色体DNA向受体细胞转移，F因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入受体细胞中，故HfrF-杂交后的受体细胞(或接合子)大多数仍然是F-。,.,108,3）FF-,给体的部分染色体基因随F一起转入受体细胞，形成F细胞，细胞基因的这种转移过程又常称为性导、F因子转导。,.,109,（四）原生质融合（原核、真核）,通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。,.,110,.,111,二、真核微生物的基因重组,能产生单倍体有性孢子的微生物：能进行有性杂交,通过减分裂中的染色体交换和随机分配而导致基因重组。有性杂交：不同遗传型微生物的性细胞发生接合和重组的现象,1、有性杂交,.,112,有性杂交,.,113,不产生有性孢子的微生物：可通过准性生殖而进行基因重组。它是一种较为低级的有性生殖过程。准性生殖：不同遗传型微生物体细胞的核融合而导致的一种低频率基因重组现象。,2、准性生殖,.,114,.,115,（1）菌丝联结:发生在同种不同菌株的体细胞间(单倍体)（2）形成异核细胞：具有不同性状的两株菌丝互相连接，进行质配，两个不同基因型的核独立存在。这样的菌丝体称为异核体。（3）核融合（核配）：异核细胞不够稳定，二倍体细胞较为稳定。异核体中不同基因型的2个核有少数可发生核融合，进行核配，形成二倍体核。,准性生殖分为4个过程,.,116,（4）体细胞交换和单元化二倍体虽然比较稳定，但稳定性是相对的，其后代仍有一些分离现象。通过分离，可获得少数分离子。在分离过程中，染色体有可能发生交叉而产生重组体；或者丧失一整套染色体，形成单倍体；或者或多或少地丧失一套染色体，形成非整倍体。在这里，产生重组体的过程，称为体细胞交换。产生非整倍体或单倍体的过程称为单元化。,.,117,第五节、微生物菌种选育,选种：是根据微生物的特性，采用各种分离筛选方法,从自然界中或从生产实践中选出适合人们要求的菌种。育种：是根据微生物遗传变异的原理，在已有的菌种基础上，采用诱变或杂交的方法，迫使菌种发生变异，然后在变异的菌株中挑选出符合生产实际要求的菌种。,.,118,一、从自然界中选种,样品采集增殖培养分离纯化性能测定,根据目的到最合适的地方去。土壤是微生物的大本营，种类多，数量大，因而是最常采集样品的地方。,1、样品采集,步骤,.,119,（1）土壤肥瘦：有机质较多的土壤含微生物也多。肥土细菌多。园林土、农田土放线菌多。分离真菌，采集富有植物残体的土样较为合适。（2）采土深度：5-20cm处较好。（3）采土季节：以春秋二季为宜。（4）采土方法：选择地点用小铲子除去表面取520cm处的土壤几十克放入事先灭过菌的纸袋内。同时记录时间、地点、植被等情况，采土后要尽快分离。,采土的时候，以下几点值得注意：,.,120,2、增殖培养,原因：采集到的样品，可能含有我们所需要的微生物，但往往数量较少，而且杂菌混生，因而不易直接分离纯化，需要增殖培养。方法：往样品中加入适合某些微生物生长繁殖的物质,或创造适合某些微生物生长繁殖的环境条件,这样就促进了某些微生物的大量繁殖。,.,121,1）往上样中加入一些石油，能利用石油的微生物容易生长繁殖；2）把土样加入到含糖浓度高的培养基中，并把pH值调到4以下，就可使酵母菌得到增殖。3）要筛选芽孢杆菌，先将样品加水后于80处理10分钟，非芽孢菌迅速死亡，使芽孢杆菌的浓度得到提高。,举例：,.,122,3、分离纯化,（1）平板划线分离法：最常用的方法。（2）稀释涂布（倾注）分离法（3）单孢直接挑取法,.,123,平板划线分离法,.,124,稀释涂布（倾注）分离法,.,125,.,126,Spreadplatemethod,Pourplatemethod,.,127,.,128,1）粗测(初筛):起定性的作用，可在培养皿上进行。2）精测（复筛）：起定量的作用。试验要接近生产工艺条件初筛工作量大,复筛手续繁琐.如二者结合,则可提高效率例如：头孢霉素生产菌的选育:按抑菌圈直径和菌落直径的比值进行初筛，其结果与摇瓶发酵产量一致，提高了筛选效率。,4、筛选,.,129,.,130,5、毒性试验,保证食品的安全性,.,131,诱变育种是利用物理诱变剂、化学诱变剂和生物诱变剂处理微生物群体，诱发基因发生突变，然后根据育种目标，从无定向的突变株中，筛选出我们所需要的菌种。,二、诱变育种,.,132,致癌物（诱变剂）检测试验Ames试验,“生物化学统一性”法则：人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的。,Ames试验的依据,诱变剂的共性原则：化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比。,.,133,美国加利福尼亚大学的BruceAmes教授于1966年发明，因此称为Ames试验。,化学致癌物质的检测Ames试验,检测鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型菌株的回复突变率。,.,134,Ames试验方法,.,135,1诱变育种的程序：,出发菌株,菌种纯化,制备孢子或悬液,诱变处理,性能测定,活菌计数,平板涂布,挑变异菌斜面培养,形态观察,斜面传代,性能初测,放大试验,用于生产,性能精测,.,136,3、出发菌株的选择,出发菌株即用于育种的原始菌株。选择好出发菌株，相当重要。根据实践经验:1）选用已经经过生产选育过的菌株；2）选用本身起码能少量积累所需产品或其前体的菌株；3）选用几次诱变处理均能提高产量的菌株；4）选用形态发生变异以后的菌株等，效果较好。,.,137,4孢子（或菌体）悬浮液的制备,1）选用单细胞或单孢子悬液（均匀、分散）,目的：使每个细胞能均匀接触诱变剂；减少表型延迟现象（诱变后性状的分离及退化现象）,2）同步培养（生理状态一致）,3）菌龄,营养细胞：对数期；孢子或芽孢：萌发前期,.,138,4）菌悬液的制备方法,5）菌悬液的浓度,物理诱变：生理盐水配制化学诱变：缓冲液配制,酵母菌，霉菌的孢子：106个/mL细菌，放线菌孢子：108个/mL,.,139,5、诱变剂处理的剂量,物理诱变剂:紫外线、x射线、射线、快中子化学诱变剂：氮芥、乙烯亚胺、硫酸二乙酯、亚硝基胍等。其中亚硝基胍被认为是超诱变剂，诱变效率特别高。用它诱变处理后可以直接得到12-80的营养缺陷型,而一般诱变剂处理中最多也不过百分之几。,（1）选择简便有效的诱变剂：,.,140,（2）确定合适的剂量,剂量的表示方法：常用杀菌率表示诱变剂的剂量。杀菌率=（mn）/m100m：未被处理菌体长出的菌落数n：被处理菌体长出的菌落数使用剂量：一般剂量诱变率，但达到一定剂量后剂量诱变率。采用杀菌率为70-80的剂量，特别是经过一再诱变的高产菌株。,.,141,（3）处理方法,波长：257.3nm附近杀菌和诱变作用最强。剂量：一般紫外线灯的功率固定为15W，灯与处理物之间的距离也固定在30cm。照射时间：微生物种类不同照射时间不同：抗生素产生菌的孢子:0.5-2min枯草杆菌和短小芽孢杆菌营养体营养缺陷型:1-3min,以紫外线作为物理诱变剂的代表,.,142,一次处理和分次处理的效果一样。但时间间隔不能太久。5s+5s=10s具体操作：开灯预热20min(使光波稳定)5mL菌悬液6cm培养皿离灯30cm处照射。注意:a.培养皿底要平整并要摇动或利用磁力搅拌设备，以求照射均匀。b.对于有光复活作用的菌体,照射后须在红光下操作。c.处理后的菌悬液增殖培养期间，可用黑纸包住平皿。,.,143,6中间培养,表型延迟：表型的改变落后于基因型改变的现象。可分为分离性延迟和生理性延迟,.,144,7、突变株的筛选：,（1）产量突变株的筛选：琼脂块培养法（2）抗药性突变株的筛选：梯度平板法（3）营养缺陷型突变株的筛选：影印平板法（4）形态、色素、酶活性和抗性突变株的筛选,.,145,产量突变株的筛选琼脂块培养法,.,146,梯度平板法：在含有药物的平板上定向培育筛选抗抗代谢物异烟肼（吡哆醇类似物）突变株。,抗药性突变株的筛选,.,147,异烟肼,吡哆醇,抗性突变株的两种可能：a.有解异烟肼酶b.产吡哆醇更多,.,148,营养缺陷型突变株选育方法:诱变淘汰野生型检出鉴定营养缺陷型诱变淘汰野生型:抗生素法、菌丝过滤法检出缺陷型：同一平板夹层培养、限量补充不同平板影印接种、逐个检出鉴定营养缺陷型：生长谱法,营养缺陷型突变株的筛选,.,149,夹层培养法检出缺陷型,.,150,影印平板法,Velveteen(锦绒布）Auxotroph(营养缺陷型)Prototroph(原养型),.,151,生长谱法鉴定缺陷型,图中标号表示添加了不同生的长因子在标号对应的位置有生长圈的就是该种生长因子的缺陷型。,.,152,形态：避免挑取形态发生变化的菌落，特别是不产孢子的菌落。但是也有例外，万古霉素生产菌经紫外三次累积诱变后，发现菌落形态由原梅花型变为白色微小菌落，再经紫外线和5-氟尿嘧啶处理，菌落形态变为无规则皱纹状，孢子颜色由原来黄色变为土黄色，而效价有较大提高。,形态、色素、酶活性和抗性突变株的筛选,.,153,色素：对于产生色素的菌落，特别从有色变为白色者，更要挑选出来。酶活性：实践中常采用特别方法加以测定。例如在含有酪蛋白的培养基上，是否有透明圈出现，以及透明圈大小可用来判断该菌是否能产生蛋白酶以及酶活力的强弱。抗生素：由抑菌圈的大小和菌落直径的比值来筛选高产菌株。,.,154,第四节菌种的退化、复壮和保藏,（一）常见的菌种退化现象：,3对生长环境的适应能力减弱,2生产性能的下降,1菌落和细胞形态改变,一、菌种的退化,.,155,（二）菌种退化的原因,1有关基因的自发突变2育种后未经很好的分离纯化3培养条件的改变4污染杂菌,.,156,（三）防止退化的措施,1、控制传代次数，降