社区医院检验专业技能培训

革兰染色法(Gramstain)(一)原理：几种学说1、等电点学说：G+菌的等电点比G-菌的等电点低，在同一pH条件下，阳性菌比阴性菌所带电荷要多，与带正电荷的碱性染料结合力强，不易脱色。,2、化学学说：G+菌含有大量核糖核酸镁盐，与进入细胞浆内的结晶紫和碘牢固结合成大分子复合物，不易被95乙醇脱色，而G-菌含此种物质少，故易被乙醇脱色。,3、细胞壁结构学说：G+菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚且具有三维空间结构，脂类含量低，乙醇不易透入，而且95乙醇可使细胞壁脱水，细胞壁间隙缩小，通透性降低，阻碍结晶紫和碘的复合物渗出，而G-菌的细胞壁较疏松，肽聚糖层薄且无三维空间结构，含脂质量高，,易被乙醇溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫和碘的复合物被溶出而脱色。目前认为细胞壁与化学组成上的差异是染色反应不同的主要原因。,(二)试剂：l、结晶紫溶液2、革兰碘液3、95乙醇4、稀释石炭酸复红,(三)操作步骤：细菌标本涂片固定后，先用结晶紫(或龙胆紫)初染lmin；小水流冲洗后加碘液媒染1min；小水流冲洗后用95乙醇脱色1min；小水流冲洗后稀释复红复染30sec，小水流冲洗后使涂片自然干燥，镜检。,(四)结果判定：1、革兰阳性细菌：不被乙醇脱色仍保留紫色为革兰阳性菌(G+菌)，如葡萄球菌、链球菌等。2、革兰阴性细菌：若被乙醇脱色后再被复染成红色者，为革兰阴性菌(G-菌)，如大肠埃希菌、伤寒沙门菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等。,(五)革兰染色的重要实际意义：1、鉴别细菌：可将所有细菌分为革兰阳性菌和革兰阴性菌两大类，有助于进一步鉴别。2、选择药物的参考，临床上可根据病原菌的革兰染色性，考虑选择有效的药物进行治疗。,3、与致病性有关：许多革兰阳性菌能产生外毒素，而革兰阴性菌则大多能产生内毒素，两者致病作用不同。,细菌的接种方法(一)器材：l、接种针和接种环:它们由镍铬合金或白金丝制成。接种环的直径约2-4mm，一个合格的接种环是正圆形，连接端没有空隙；接种针长5080mm。两者上端连接有一绝缘柄的金属棒，全长为145mm。,2、固体培养基3、酒精灯,(二)接种方法：主要应用平板划线法。另外还有琼脂斜面接种法、穿刺接种法、液体培养基接种法、倾注平板接种法和涂布接种法。平板划线法分为分区划线法和连续划线法。,(三)平板划线法操作步骤：1、接种环在火焰上灭菌。2、用灭菌后的接种环取标本。3、在固体培养基上划线接种。(四)判断接种效果：要求接种后平板上划线轨迹连续、平滑，平行的划线之间不可重合，平板经孵育培养后，应沿划线出现单个菌落。,室内质控操作步骤(一)前期准备工作室内质控分为最佳条件下的变异(OCV)和常规条件下的变异(RCV)两种情况，前者反映实验室最佳状况下的质控情况，而后者反映实验室日常情况下的质控情况。,l、最佳条件下的变异(OCV)OCV表示本室在当前条件下该项目检测所能达到的最好精密度水平，是本室工作水平的一个基础指标。OCV测定采用与常规工作相同的检测方法、试剂和仪器，但应保证测定是在本室所能达到的最理想、最稳定的情况下进行。,比如所用仪器等应新近经过校准，试剂新鲜配制，由操作熟练、富有经验的人员进行。在测定全过程中应尽量控制温度、光照、反应时间等一切可能影响测定结果的因素。,选择瓶间差小、稳定性良好的质控品，每天做4、5批测定，每批一瓶质控品，在4、5天内即可得到至少20份数据，分别计算其、S、CV值，此CV值即为OCV。所测得的OCV综合表达了批间和日间精密度。,2、常规条件下的变异(RCV)RCV表示本室在当前条件下常规工作中该项目检测的精密度水平。RCV的测定方法与对应的OCV测定方法相似。不同点仅在于测定RCV时应使用与常规工作完全相同的条件，而不要有任何特殊对待。,即应当把质控品完全当成病人标本，每天由该项目常规检测的操作者将它随病人标本同批检测，以便真实反映常规检测的精密度。在常规室内质量控制工作中，每更换一次质控品的批号，,均应对新批号的质控品进行RCV测定。RCV是常规条件下的变异，是日间精密度的表达指标。因此，测定时质控品必须保证使用和标本相同的处理条件，而且每天要重新启用一瓶，并只测一次。,20个数据要来自20天测定。一天内测多个数据，甚至一批内测多个数据，或每天将一瓶质控品分成若干份，测定后求均值作为当天的数据等做法均是错误的。这样得出的RCV往往比真实情况要小一些。RCV的计算方法与OCV完全相同。,3、室内质量控制工作的进行完成了OCV和RCV的测定和计算后，根据计算出的靶值和允许误差范围等数据绘制质控图，然后正式开始常规工作中的室内质量控制，每天随常规标本对该批质控品进行测定，并将结果画在基于RCV测定得到的质控图上。,特别要注意的是，根据RCV绘制的质控图对于同一批号质控品是不变的，它与每个月常规室内质量控制工作中所得到的数值无关。,(二)室内质控的实际操作设定质控图的中心线(均值)(1)暂定中心线(均值)的确定在开始室内质控时，首先要建立质控图的中心线(均值)。均值必须在实验室内使用自己现行的测定方法进行确定。,定值质控品只能作为确定中心线的参考，不能用质控品上标明的量作为均值。为了确定中心线，新批号的质控品应与当前使用的质控品一起进行测定。根据20或更多批获得的质控测定结果，对数据进行离群值检验(剔除超过3s外的数据)，计算平均值，作为暂定中心线(均值)。,此暂定中心线作为下一个月室内质控图的中心线(均值)进行室内质控；一个月结束后，将该月的在控结果与前20个质控测定结果汇集在一起，计算累积平均值(第一个月)，以此累积的平均数作为下一个月质控图的中心线(均值)。重复上述操作过程，连续35个月。,(2)常规中心线(均值)建立以最初20个数据和3-5个月在控数据汇集的所有数据计算的累积平均数作为质控品在有效期内的常规中心线(均值)，并以此作为今后室内质控的中心线(平均值)。,对个别在有效期内浓度水平不断变化的项目，则需不断调整中心线(均值)。,(二)设定控制限对新批号质控品应确定控制限，控制限通常以标准差倍数表示。1、稳定性较长的质控品(1)暂定标准差的设定操作过程与设定中心线(均值)过程基本相同，只是计算公式不同。,(2)常规标准差的设定(同上)以前的标准差是几个月数据的简单平均或者是累积的标准差。标准差等于平均数乘以变异系数。,2、控制限的确定通常以标准差的倍数表示控制限。在日常测定中，连续测定同一批号的质控血清20天以上或一个月，求出均值和标准差，再确定质控上限(UCL)和质控下限(LCL)。,(三)室内质控的具体操作程序以均值-标准差(X-SD)质控图为例：1、目的：监测分析的精密度。2、方法：每天将质控品随病人标本在相同的条件下(环境、仪器、试剂和操作者)进行测定，并将测定结果描绘在事先做好的质控图上。,三分类血细胞分析仪(COULTERSTKS血细胞分析仪)(一)工作原理运用电阻抗原理测量细胞大小和对细胞进行计数，用比色法来测定血红蛋白，通过VCS技术对白细胞系统进行分类计数。,(二)操作方法分两种模式：手工操作模式和自动进样模式。1、手工操作模式：检查各种试剂存量启电源STARTUP冲洗仪器检查仪器空白背景是否正常*仪器准备就绪用质控品操作检查各参数是否在控*输入样本条型码号将样本插入吸样针内,按START分析开始，结束准备就绪分析后检查试剂按SHUTDOWN运行关机程序关闭电源。,2、自动进样模式：检查各种试剂存量开启电源按STARTUP冲洗仪器检查仪器空白背景是否正常*仪器准备就绪用质控品操作检查各参数是否在控*设置样本号和条形码号将样本放入试管架内,将试管架放入进样池中按START分析开始，结束准备就绪分析后检查试剂按SHUTDOWN运行关机程序关闭电源。,说明：*一般要求WBC02*109L，RBC：005*1012L，Hb01，有的试剂空白不加酶，此时应参考阴性OD，如其也O1，或者整个反应板均有浅色，即一般本底O1时，则本底过高。处理：(1)增加洗板次数，(2)缩短孵育时间，(3)缩短显色时间，(4)请试剂厂家协助调整试剂的生产工艺。,2、高值阳性对照OD值过低一般高值阳性对照OD值低于05，在排除操作问题后，多为试剂问题，应与试剂厂家联系，请协助解决。操作问题主要有(1)样品不够，有气泡等，尤其是容器与要求规格不符时易出现。此时预检测往往显示足够，但吸样不足，因加样时有的仪器无提示。,(2)确认程序是否正确，此问题只在编好程序试运行时出现，一旦调试好后，以后不会再出现，除非程序被改动。,3、花板多为交叉污染所致，例如加样时溢出，污染其他孔，或者加样时没有更换吸头。4、白板多为试剂盒质量或者过期，此外还见于洗涤过度、未加酶标抗体或抗原、未加底物等。,(四)室内质控1、质控物选择一般使用试剂厂家提供的阳性和阴性对照品，或者是定值质控品。2、质控方法按照常规质控方法进行。,附：半自动酶标仪(