蛋白质的分离纯化方法

一种分离纯化蛋白质的方法2.1根据不同的分子大小进行分离纯化蛋白质是一种大分子物质，不同蛋白质的分子大小不同，所以可以用一些更简单的方法来制造蛋白质定性物质和小分子物质被分离，蛋白质混合物也被分离。根据蛋白质分子的大小，主要的分离方法是透析、超滤、离心和凝胶过滤。透析和超滤是常用的蛋白质分离方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中，然后浸入透析液中进行分离。超滤是一个过程，其中水和其他小分子被离心力或压力迫使通过半透膜，而蛋白质被截留在半透膜上。这两种方法都可以将蛋白质大分子和由无机盐控制的小分子分开。它们通常与盐析和盐溶解方法结合使用，盐析和盐溶解方法可用于在盐析或盐溶解后除去引入的无机盐。在超滤过程中，滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞，从而减慢超滤速度并降低堵塞物质的分子量。因此，采用超滤法时，应选择合适的滤膜，也可选择切向流过滤，以获得更理想的效果。离心也是一种分离蛋白质的方法，经常与其他方法结合使用。当蛋白质和杂质的溶解度不同时，它们可以通过离心分离。例如，在从米渣中提取蛋白质的实验中，加入纤维素酶和-淀粉酶进行预处理，然后通过离心3初步分离有用物质和分解的杂质。在具有密度梯度的介质中离心蛋白质的方法称为密度梯度(区域)离心。常用的密度梯度包括蔗糖梯度、多糖梯度和其他合成材料的密度梯度。可以根据所需的密度和渗透压范围选择合适的密度梯度。用密度梯度离心法纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白，所得产品纯度高，但产率低。蒋晨等6通过比较不同密度梯度介质的分离效果，采用溴化钠密度梯度，获得了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤，也称为凝胶渗透色谱，是根据蛋白质分子大小分离蛋白质的最有效方法之一。凝胶过滤的原理是，当不同的蛋白质流过凝胶色谱柱时，孔径大于凝胶珠的分子不能进入珠中的网络结构，而是被排除在凝胶珠之外，并随着凝胶珠之间间隙中的溶剂向下移动，首先流出色谱柱。相反，孔径小于凝胶珠的分子流出色谱柱。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。在甘露糖蛋白的纯化过程中，可以采用凝胶过滤法获得良好的结果。纯度鉴定证明该产物是分子量约为32 kDa的单一均质糖蛋白，是多糖：蛋白质(88: 12)的一种组分，是甘露糖1的一种多糖。凝胶过滤也用于去除抗凝血蛋白提取中的大多数外来蛋白和小分子杂质7。2.2根据不同溶解度进行分离纯化影响蛋白质溶解度的外部条件有很多，如溶液的酸碱度、离子强度、介电常数和温度。然而，在相同的条件下，不同的蛋白质由于其不同的分子结构而具有不同的溶解度。根据蛋白质分子结构的特征，可以通过适当改变外部条件来选择性地控制蛋白质混合物中组分的溶解度，以达到分离和纯化蛋白质的目的。常用的方法包括等电点沉淀和调节酸碱度、蛋白质的盐溶解和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶束萃取法等。等电点沉淀和调节酸碱度是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点，在等电点时溶解度最高。低；相反，一些蛋白质在一定的酸碱度下很容易溶解。因此，可以通过调节溶液的酸碱度来分离和纯化蛋白质。王红新等人8研究了茶叶蛋白的提取工艺，发现茶叶蛋白的提取效果在酸碱度下最好，提取率为368%，初步纯化率为910%。李殿宝9从向日葵脱脂粕中提取蛋白质时，将蛋白质溶液的酸碱度调至3-4，使目标蛋白质在等电点沉淀。等电沉淀法也用于从葡萄籽中提取蛋白质。李等10测得葡萄籽蛋白的等电点为38。采用碱溶法提取葡萄籽蛋白，最佳提取工艺为：用110-5 mol-1的氢氧化钠溶液，按料液比1: 5，在40搅拌40 min，葡萄籽蛋白提取率达到73.78%。此外，大米蛋白可以用碱法提取，其保水性、吸油性和起泡性均优于酶法提取的11。酸法提取的鲢鱼蛋白无腥味，色泽洁白，蛋白质得率高达90%12。蛋白质的盐溶解和盐析是中性盐显著影响球状蛋白质溶解度的现象。蛋白质溶解度增加的现象称为盐溶解，而盐析则相反。应该指出的是，具有相同浓度的二价离子的中性盐，如氯化镁和(NH4)2SO4，比一价离子的中性盐，如氯化钠和氯化铵，对蛋白质溶解度有更大的影响。在葡萄籽蛋白质的提取过程中，不仅可用碱溶液法提取蛋白质，也可用盐溶液法提取蛋白质。最佳提取工艺为：用10%的氯化钠溶液和1: 25的固液比，在30搅拌提取30分钟，蛋白质提取率为5725%10。盐析法是从血液中提取免疫球蛋白的常用方法，如聚磷酸钠絮凝法和硫酸铵盐析法，其中硫酸铵盐析法在生产中应用广泛。由于硫酸铵在水中是酸性的，所以氨水被用来调节酸碱度到中性，以防止它对蛋白质的损害。为了防止不同分子间的共沉淀，蛋白质样品的含量一般控制在02% 20%。蛋白质通过盐溶解和盐析纯化后，中性盐通常通过透析或凝胶过滤除去13。有机溶剂萃取法的原理是，有机溶剂(如甲醇和乙醇)与水互溶可显著降低某些蛋白质在水中的溶解度。此外，在一定的温度、酸碱度和离子强度下，导致蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度是不同的，因此，可以通过控制有机溶剂的浓度来分离和纯化蛋白质。例如，在冰浴中磁力搅拌下，将乙醇(-25)缓慢加入到在4预冷却的培养溶液中以沉淀冰核蛋白，从而纯化冰核蛋白14。在室温下，有机溶剂不仅会导致蛋白质沉淀，还会伴随变性。因此，通过冷却有机溶剂，然后在连续搅拌下加入有机溶剂以防止局部浓度过高，可以在很大程度上解决蛋白质变性问题。对于一些与脂质结合紧密或分子中有更多极性侧链且不溶于水的蛋白质，可以用有机溶剂如乙醇、丙酮和丁醇提取。它们具有一定的亲水性和强的亲油性，是理想的萃取溶液。冷乙醇分离法是由Cohn于1949年首次提出的用于制备免疫球蛋白的方法。目前世界卫生组织和中国生物制品法规也推荐使用冷乙醇法。它分辨率高，纯化效果好，能同时分离各种血浆成分，具有抑菌、去除和杀灭病毒的作用，15。萃取是分离和纯化有机化合物的常用方法，而双水相萃取和反胶束萃取可用于分离蛋白质。双水相萃取，ATPE)是指在一定条件下亲水聚合物水溶液形成双水相。由于分离物质在两相中的不同分布，可以实现分离。ATPE广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化学工程领域的产品分离和提取。该方法可以在室温下进行，并且双水相中的聚合物也可以高产率地提高蛋白质的稳定性。对于细胞中的蛋白质，首先需要有效地压碎细胞。目标蛋白质通常分布在上层并浓缩，而固体物质如细胞碎片分布在下层。感兴趣的蛋白质通过双水相系统浓缩，双水相系统受聚合物的分子量和浓度、溶液的酸碱度、离子强度、盐类型和浓度16的影响。反胶束萃取法利用反胶束将蛋白质包裹在其中，达到萃取蛋白质的目的。反胶束被用作表面活性剂当非极性有机溶剂溶解时，由自发聚集形成的纳米大小的聚集体。这种方法的优点是在提取鸡蛋的过程中白色物质受到反胶团的保护，因为它位于反胶团内部。程世贤等人用反胶束萃取法从大豆中提取蛋白质。2.3根据不同的电荷进行分离和纯化根据蛋白质的电荷，即酸碱性质，有两种方法来分离蛋白质：电泳和离子交换色谱。在外部电场的作用下，带电粒子(例如，不处于等电点状态的蛋白质分子)将向具有相反电特性的电极移动这种现象被称为电泳。聚丙烯酰胺电泳是一种以聚丙烯酰胺为介质的区域电泳，常用于分离蛋白质。其优点是设备简单，操作方便，样品消耗少。等电点聚焦是一种高分辨率的蛋白质分离技术，也可用于蛋白质的等电点测定。通过等电聚焦分离蛋白质混合物是在具有酸碱度梯度的介质中进行的。在外部电场的作用下，各种蛋白质将向等于其等电点的酸碱度梯度移动并聚焦，形成一个窄带。孙等18研究了聚丙烯酰胺电泳、等电聚焦电泳和等速纯化电泳在蛋白质分离纯化中的应用。结果表明，聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较低的条带分辨率和较低的进样量。等电聚焦电泳具有最高的分辨率，可以用最少的样品量分离同一蛋白质的亚组分。等速纯化电泳区分辨率高，样品可分为单一组分，样品加入量最大。离子交换色谱是一种使用离子交换剂作为固定相的色谱方法，根据可逆交换过程中流动相中的组分离子和交换剂上的平衡离子之间结合力的不同进行分离。在离子交换色谱中，基质由带电的树脂或纤维素组成。正电荷是阴离子交换树脂；相反，它是阳离子交换树脂。离子交换色谱法也可用于蛋白质的分离和纯化。当蛋白质处于不同的酸碱度时，它们的充电条件也不同。阴离子交换基质结合带负电荷的蛋白质，并留在色谱柱上。通过增加洗脱液中的盐浓度，吸附在色谱柱上的蛋白质被洗脱，其中结合较弱的蛋白质首先被洗脱。相反，阳离子交换基质结合带正电的蛋白质，结合的蛋白质可以通过逐渐增加洗脱液中的盐浓度或增加洗脱液的酸碱度来洗脱。李等19应用离子交换色谱法纯化浓缩苹果汁中的蛋白质。此外，离子交换色谱法也用于提取抗凝血蛋白7。2.4使用对配体的特异性亲和力进行分离和纯化亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子的特异性识别能力(即生物亲和力)建立的一种有效的纯化方法。通常只需要一步处理就能从复杂的混合物中分离出目标蛋白，纯度相当高。亲和色谱的应用需要了解纯化物质的结构和生物学特性，以便设计最佳的分离条件。近年来，亲和层析技术已广泛应用于靶蛋白的分离和纯化，尤其是疫苗，尤其是融合蛋白的分离和纯化。亲和层析起着重要的作用，因为融合蛋白具有特异的结合能力20。亲和层析也广泛用于分离和纯化基因工程亚单位疫苗21。樊等22用壳聚糖亲和层析法提取的抑肽酶比活性达到71428 BAeegM-1，纯化回收率达到625%。该方法成本低，吸附剂价格低，机械强度高，抗污染能力强，非特异性吸附小，可重复使用，适用性广，产品质量稳定。3展望在实际工作中，很难用单一的方法分离和纯化蛋白质。通常需要结合几种方法来纯化蛋白质。理想的蛋白质分离和纯化方法要求产品纯度和总回收率越高越好，但实际上很难将