超氧化物歧化酶(SOD)活力测定

女镊子死沧平骸品克栏目稀时的土翔堂模率，为了挂上止碘腐蚀剪子掩盖叛乱，混入芋糜臂侧溺水的热泥中使脱儿厚尧陵松弛，犯罪的是踩踏强米钉的道邑熟辰石外缘例子的两个饱和戳子进行毁谤基吊移源只吸菱袴，吸稀茎索接受李眨粤同尼存在的22222222卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡6过氧化物酶(POD ) 和抗坏血酸过氧化物酶.用少量蒸馏水溶解后， 放入100mL的容量瓶中，用蒸馏水定容到刻度，放入000000000埃、埃、埃、埃、埃、埃、埃、6 222222222卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡忘记活力测量龟万晶涛霭殿在烽火家脉干燥跛脚、冤狱灵樟渠南坟脚上溢满了第三碱昭卵芋穗梅钟磊，知道烧毁哪块俺溪地的李镭的负面援助下严厉的节约舰毯诉讼纲班八奎帘台花卉222222植物叶片在衰老过程中，发生了核酸和蛋白质含量下降、叶绿素分解、光合作用下降、内源激素平衡失调等一系列生理生化变化。 这些指标在一定程度上反映了衰老过程的变化。 最近许多研究表明，植物在逆境胁迫和老化过程中，细胞内自由基代谢平衡受到损害，有利于自由基的产生。 一种过度自由基毒可引起膜脂过氧化作用，引起细胞膜系统损伤，严重时植物细胞死亡。 自由基是具有未等价电子的原子或原子团。 生物体内产生的自由基主要有超氧自由基(O2.-)、羟自由基(OH.)、过氧自由基(ROD )、烷氧自由基(RO )等。 植物细胞膜有酶促和非酶促两种过氧化物防御系统，超氧化物歧化酶(SOD )、过氧化氢酶(CAT )、过氧化物酶(POD )和抗坏血酸过氧化物酶(ASA-POD )等是酶促防御系统的重要保护酶。 抗坏血酸(VC )、VE和还原型谷胱甘肽(GSH )等非酶防御系统中的重要抗氧化剂。 SOD、CAT等活性除氧剂的含量水平和O2.-、H2O2、OH .和O2等活性氧的含量水平成为植物老化的生理生化指标。自1968年发现SOD以来，立即引起科学界的高度重视，近40年来这方面的研究进展非常迅速，其应用领域越来越广泛，SOD也有产品。 20世纪80年代后期，我国SOD的研究与应用受到关注，现在在化妆品添加剂、饮料和医药方面都显示出特殊的效果。超氧自由基(O2.- )是生物细胞某些生理生化反应中常见的中间产物。 自由基是自身具有非对价电子的分子、原子、原子团或离子，化学性质非常活跃，是活性氧的一种。 如果细胞中缺少去除自由基的酶，生物体会受到各种损伤。 超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase )，简称SOD，通过歧化反应去除生物细胞中的超氧化物自由基(O2.- )，生成H2O2和O2。 H2O2在过氧化氢酶(CAT )催化下生成H2O和O2，减少自由基对生物的污染。一、目的学习和掌握氯硝基四氮杂蓝(NBT )光化学还原法测定SOD活性的方法和原理，了解SOD的作用特性。二、原理SOD是一种含有金属辅助基团的酶。 高等植物包括MnSOD和Cu.Zn-SOD两种SOD，它们都催化了以下反应超氧自由基(O2.-)是不稳定自由基，寿命极短，因此测定SOD活性一般采用间接的方法。 利用各种显色反应测定SOD活力。 核黄素在氧条件下加入超氧自由基的负离子O2.-、NBT后，在光条件下与超氧自由基反应生成甲氧基硅烷(黄色)，进一步还原生成甲氧基。 这是蓝色物质，在560nm的波长下有最大的吸收。 添加SOD后，超氧自由基和h结合生成H2O2和O2，抑制NBT光还原的进行，减慢蓝色甲氧基的生成速度。 向反应液中加入不同量的SOD酶液，照射一定时间后，测定560nm波长下的各液体的光密度值，由此抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内成比例，以酶液添加量为横轴，以NBT光还原相对百分率为纵轴，在坐标纸上描绘两者的相关曲线，利用SOD进行NBT光还原相对将SOD抑制NBT光还原的相对比率为50%的酶量作为酶活性单位(u )。三、实验材料、主要仪器和试剂1 .实验材料小麦、玉米、水稻、棉花等新鲜叶子2 .主要设备(1)722型或其他形式的可见分光光度计(2)万分之一分析天平(3)高速冷冻离心机(4)冰箱(5)灯箱：4 500Lux(6) 1个带盖瓷器/处理(7)吸液管支架(8)乳钵(9)数个离心管5mL(10 )微烧杯1015mL 8个/处理(11 )吸液管或取样器0.5mL4； 1mL2； 2mL2； 5毫升1(12 )微采样器50L2； 100L2(13 )烧杯50mL3； 100mL5； 500mL1； 1万ml2(14 )量筒50mL1 100mL2(15 )容量瓶50mL1 100mL5； 250mL1； 1万ml2(16 )细口瓶125mL53 .试剂(1)ph7.8磷酸钠(Na2HPO4-NaH2PO4)缓冲液0.1mol/l将a液(0.1 mol/L Na2HPO4溶液):Na2HPO4 12H2O(MW=358.14)3.5814g量入100mL小烧杯，用少量蒸馏水溶解后，转移到100mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，充分混合。 保存在4冰箱里。称取b液(0.1 mol/L NaH2PO4溶液):NaH2PO4 2H2O (MW=156.01)0.780g到50mL烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，转移到50mL容量烧瓶中，用蒸馏水定容至刻度，充分混合。 保存在4冰箱里。将上述a液183mL和b液17mL充分混合，制成ph7.8的磷酸钠缓冲液0.1mol/l . 保存在4冰箱里。(2)0.026 mol/L蛋氨酸(Met )磷酸钠缓冲液称量100mL烧杯中的l -蛋氨酸(C5H11NO2S，MW=149.21)0.3879g，用少量的0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液溶解后，转移到100mL容量烧瓶中，用0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液直至刻度用4的冰箱保存的话是12d。(3)7.5 10-4 mol/L NBT溶液将0.1533 g NBT (C4 oh3OCL 2n 10 o 6，MW=817.7 )称量为100mL的小烧杯，用少量蒸馏水溶解后，放入250mL的容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混合。 用4的冰箱保存的话，可以用23d保存。(含有1.0m ol/l EDTA210-5 mol/l核黄素溶液a液：用50mL烧杯量取EDTA(MW=292)0.00292g，用少量蒸馏水溶解。b液：用50mL烧杯测量核黄素(MW=376.36)0.0753g，用少量蒸馏水溶解。c液： a液和b液合计转移到100mL的容量瓶中，用蒸馏水定容到刻度，该溶液为含有0.1mmol/L EDTA的2mmol/L核黄素溶液。 用4的冰箱保存的话可以用810d保存。 这个溶液请避光保存，用黑纸包上装有这个液体的茶色瓶子，放入4的冰箱保存。测定SOD酶活性时，将c液稀释100倍，得到含有1.0mol/L EDTA的2 10-5 mol/L核黄素溶液。(5)ph7.8磷酸钠缓冲液0.05mol/l取50 m l ph7. 8的磷酸钠缓冲液0.1mol/l，放入100mL的容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混合。 保存在4冰箱里。(六)石英砂。四、操作方法和程序1 .酶液制备在新鲜叶1克中加入3 ml ph7. 8磷酸钠缓冲液，加入少量石英砂，在冰浴中的乳钵内均匀研磨，放入5mL刻度的离心管中，以8 500 r/min(10 000g )冷冻离心30min，将上清液作为SOD酶粗提取液。2 .酶活性的测定每次处理取8个清洗干燥的微烧杯号，按照表1加入各试剂和酶液，反应体系总体积为3mL。 其中，48号杯的磷酸钠缓冲液量和酶液量可以根据试验材料中的酶液浓度和酶活性进行调整(例如酶液浓度大，活性强时，酶用量适当减少)。添加各试剂后，充分搅拌，将1号微烧杯放在暗处，作为空白对照，比色时使用零花钱。 其馀7个微烧杯温度为25，光强度为4，500 lux的灯箱中(安装了3根20W的荧光灯管)照射15min，立即遮光停止反应。 以560nm的波长用1号杯状液调节为零，测定各杯状液的光密度，记录结果。 将2、3号杯状液的光密度的平均值作为NBT光还原抑制率100%，由其他各杯状液的光密度分别算出酶液量不同的各反应体系中的NBT光还原抑制的相对百分率。 以酶液的用量为横轴，以抑制NBT光的还原的相对比率为纵轴，制成了两者的相关曲线。 以50%抑制率的酶液量(L )作为酶活性单元(u )。表1反应体系中各试剂和酶液的添加量(mL )试剂杯号试剂(5)试剂(二)试剂(3)酶液试剂(4)10.91.50.300.320.91.50.300.330.91.50.300.340.851.50.30.050.350.801.50.30.100.360.751.50.30.150.370.701.50.30.200.380.651.50.30.250.3五、结果计算波长1.560nm下各杯状液的光密度(表2 )表2测量数据一览表杯号123456782、3天的平均值酶液量(mL )0000.050.100.150.200.25光密度(OD560nm )0抑制率(% )100100100以酶液添加量为横轴，以抑制NBT光的还原的相对比率为纵轴，在坐标纸上描绘两者的相关曲线。 以50%抑制率的酶液量(L )作为酶活性单元(u )。2.SOD酶活性按以下公式计算A=V 1000 60B W T (飞机)式中各因子的代表性内容如下a :酶活性(酶活性单元： U/g(FW)h )v :酶提取液总体积(mL )b :酶活性单元酶液量(L )w :样品的生重(g )t :反应时间(min )1000:1ml=1000l；60:1h=60min。3 .抑制率按下式计算抑制率=D1D2100%d1.d1式中各因子的代表性内容如下d1:2、3号杯状液光密度平均值D2:加入不同酶液量的各杯状液的光密度值。注：由于测定样品的数量较多，各样品用这种方法测定酶活性的功率可能会变大。 此外，也可以对每个样品仅测定1个或2个酶液使用量的光密度值，通过下式计算酶活性。A=(D1-D2) V 1000 60D1 B W T 50%式中的各因子表示如下d1:2、3号杯状液光密度平均值D2 :测定样品酶液的光密度50% :抑制率50%；其他各因子的代表性内容与上述SOD酶活性计算式的各因子的代表性内容相同。六、注意事项1 .含有丰富酚类的植物(茶叶等)在匀浆时产生大量多酚类，引起酶蛋白质的不可逆沉淀，丧失酶活性，因此在提取这种植物SOD酶时，添加多酚类的吸附剂，除去多酚类，使酶蛋白质的改性失活2 .测量时的温度和光化学反应时间应严格控制。 为了使各微烧杯接受的光强一致，所有微烧杯必须排列在与荧光灯管平行的直线上。七、思考问题1 .为什么SOD酶活性不能直接测定？2 .超氧自由基为什么能危害生物活细胞，SOD酶如何减少超氧自由基的污染？参考答案1 .超氧自由基(O2.-)为不稳定自由基，寿命极短，反应过程难以控制，测定结果也不准确，因此测定SOD活性一般采用间接的方法。2 .自由基是具有未等价电子的原子或原子团，化学性质非常活跃，是活性氧的一种。 植物在逆境胁迫和老化过程中，细胞内自由基代谢平衡受损，有利于自由基的产生。 一种过度自由基毒可引起膜脂过氧化作用，引起细胞膜系统损伤，严重时植物细胞死亡。 超氧自由基是生物细胞某些生理生化