全转录组LncRNA与CircRNA测序分析策略

2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd 全转录组测序引爆点 LncRNA/CircRNA创新研究策略及解决方案 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd 生命体中的暗物质 1 RNA-seq之“暗物质”解决方案 2 lncRNA与circRNA的分析方案 3 目 录 CONTENTS 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd 生命体中的暗物质 生命体中的暗物质 1 RNA-seq之“暗物质”解决方案 2 lncRNA与circRNA的分析方案 3 目 录 CONTENTS 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd 非编码RNA的分类 1. Housekeeping ncRNA tRNA, rRNA, snoRNA, snRNA Translation, ribosome mature, RNA splicingetc 2. Small regulatory RNA miRNA (21-24 nt), piRNA (26-31 nt), siRNA (20-25 nt DS) development and disease 3. Long noncoding RNA (lncRNA) 200 nt Most prevalent class of ncRNA XIST, HOTAIR development and disease (1) De Sacco et. al. Int. Journal of Mol. Sci. (2012), 13. (2) Taft et al., J Pathol 2010; 220: 126139, Non-coding RNAs: regulators of disease (3) Baker M. Long noncoding RNAs: the search for function. Nat. Meth. 2011;8:379383. 16,592个已注释的ncRNA的主要分类 lincRNA, 5089 Antisense RNA, 3230 snRNA, 1944 microRNA, 1756 snoRNA, 1521 miscRNA, 1187 uncategorized processed transcript, 933 other, 932 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd 非编码RNA的分类 1. Housekeeping ncRNA tRNA, rRNA, snoRNA, snRNA Translation, ribosome mature, RNA splicingetc 2. Small regulatory RNA miRNA (21-24 nt), piRNA (26-31 nt), siRNA (20-25 nt DS) development and disease 3. Long noncoding RNA (lncRNA) 200 nt Most prevalent class of ncRNA XIST, HOTAIR development and disease (1) De Sacco et. al. Int. Journal of Mol. Sci. (2012), 13. (2) Taft et al., J Pathol 2010; 220: 126139, Non-coding RNAs: regulators of disease (3) Baker M. Long noncoding RNAs: the search for function. Nat. Meth. 2011;8:379383. 4. circRNA Intronic circRNA， Exonic circRNA miRNA Sponges / R BP Sponges Cancer + Neuroscience 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd lncRNA的表达特征 与与mRNA相比相比，lncRNA一般表达量较低一般表达量较低，而组织特异性更强而组织特异性更强 Derrien et al, 2012, Genome Research Moran N. Cabili, GENES Cancer Cell 2014 NATURE REVIEWS GENETICS 2014 Elife. 2014 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd circRNA 相对于lncRNA 的特征 共价环化的共价环化的RNARNA环环 细胞中细胞中稳定性极佳稳定性极佳并且并且半衰期较长半衰期较长 已知的已知的circRNAcircRNA已有已有150000150000个个 线性的线性的RNARNA序列序列 细胞中稳定性不佳细胞中稳定性不佳 已知的已知的lncRNAlncRNA已有已有100000100000个甚至更多个甚至更多 lncRNA的特征 的特征 circRNA的特征 的特征 多多miRNAmiRNA结合位点结合位点miRNAmiRNA海绵机制海绵机制 & & 蛋白结合机制蛋白结合机制 生命体中的暗物质 1 RNA-RNA-seqseq之“暗物质之“暗物质”解决方案 解决方案 2 lncRNA与circRNA的分析方案 3 目 录 CONTENTS 关于我们：烈冰团队 4 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd 如何设计一次lncRNA的研究 课题设计与样本准备 课题设计与样本准备 测序与数据分析 测序与数据分析 后期功能验证 后期功能验证 研究目标研究目标：circRNAcircRNA，lncRNAlncRNA？NovelNovel，KnownKnown？ 实验手段实验手段：Poly APoly A（+ +），RibofreeRibofree？ 样本选择样本选择：生物学重复生物学重复？采样位置采样位置？ 研究目标研究目标：我的生物学表型是什么我的生物学表型是什么？ 分析手段分析手段：我希望分析到什么程度我希望分析到什么程度？是否需要定制化的讨论和分析是否需要定制化的讨论和分析？ 深入分析深入分析：是否需要分析最新的分析内容是否需要分析最新的分析内容，如如circRNAcircRNA？ 研究目标研究目标：我希望验证到什么程度我希望验证到什么程度？ 实验手段实验手段：是否要补充一部分高通量测序的后期验证是否要补充一部分高通量测序的后期验证？ 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd ncRNA测序与数据分析流程 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd 1.用ribozero kit 去除rRNA建库转录组寻找 可以获得更多的ncRNA序列，适合预测新 lncRNA 同时获得mRNA数据 2.polyA+富集建库 仅能获得polyA+的lncRNA 同时获得mRNA数据 寻找已知的lncRNA或者只是研究的一小部 分 lncRNA测序分析策略 环状环状RNA又如何又如何？ 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd circRNA测序与数据分析流程 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd 1.用ribozero kit 去除rRNA建库转录组寻 找 2.RNaseR去除线性RNA序列 circRNA测序分析策略 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd 历代发表文章的建库统计 更多的环状更多的环状RNA被检测 被检测 更准确的背景更准确的背景 与表达量的关系 与表达量的关系 Iju Chen, WIREs RNA 2016, 6:563579. doi: 10.1002/wrna.1294 生命体中的暗物质 1 RNA-seq之“暗物质”解决方案 2 lncRNAlncRNA与与circRNAcircRNA的分析方案 的分析方案 3 目 录 CONTENTS 关于我们：烈冰团队 4 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd 研究策略 测序 测序 质量控制 质量控制 序列比对 序列比对 预测新预测新lncRNA 预测新预测新circRNA 得到已知得到已知lncRNA ncRNA对功能影响 对功能影响 ncRNA作用机制推测 作用机制推测 circRNA/lncRNA 功能预测 功能预测 得到已知得到已知circRNA 新序列预测 新序列预测 测序数据处理 测序数据处理 数据库功能推测 数据库功能推测 实验验证 实验验证 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd lncRNA数据分析研究Known BioinformaOcs 2016 NONCODE PRIMARY DATABASES 1 GENCODE Encyclopdia of genes and gene variants hp:// (Derrien et al., 2012) 2 LNCipedia A database for annotated human lncRNA transcript sequences and structures. hp:// (Volders et al., 2013) 3 lncRNAdb lncRNAdb is a database providing comprehensive annotaOons of funcOonal long noncoding RNAs (lncRNAs) hp:// (Amaral et al., 2011) 4 lncRNAMap FuncOonal Long Noncoding RNAs Database hp:/.tw/php/ (Chan et al., 2014) 5 lncRNome lncRNome is a comprehensive searchable biologically oriented knowledgebase for long noncoding RNAs in Humans. hp:/genome.igib.res.in/lncRNome/ (BharOya et al., 2013) 6 NONCODE 4.0 NONCODE provides an integraOve annotaOon of long noncoding RNAs. hp:/ (Xie et al., 2014) 7 The FuncOonal lncRNA Data- base repository of mammalian long non-protein coding transcripts that have been experimentally shown to be both noncoding and funcOonal hp://database (Niazi and Valadkhan, 2012) 8 NRED A database of long noncoding RNA expression hp:/ bin/ncrnadb.pl (Dinger et al., 2009) SECONDARY INFORMATION DATABASES 9 ChIPBase Database for annotaOng and exploring the expression profi les and the transcrip- Oonal regulaOon of lncRNAs and other ncRNAs. hp:/ (Yang et al., 2013) 10 DIANA- LncBase Experimentally verifi ed and computaOonally predicted microRNA targets on long noncoding RNAs. www.microrna.gr/LncBase (Paraskevopoulou et al., 2013) 11 GeneCards v3 Integrated database of human genes that provides comprehensive, updated, and user-friendly informaOon on all known and predicted human genes. (Safran et al., 2010) 12 Linc2GO A human LincRNA funcOon annotaOon resource based on ceRNA hypothesis. hp:/ uke/Linc2GO/ index.html (Liu et al., 2013) 13 lncPro PredicOon of lncRNA-protein interacOons hp:/51/hmdd/lncpro/ (Lu et al., 2013) 14 lncRNABase (starBase v2.0) A database consisOng of RNARNA and proteinRNA interacOon networks idenOfi ed from 108 CLIP-Seq data sets generated by 37 independent studies. hp:/ A.php (Li et al., 2014) 15 miRcode Transcriptome-wide microRNA target predicOon including lncRNAs hp://mircode/ (Jeggari et al., 2012) 16 lncRNASNP Provides comprehensive resources of single nucleoOde polymorphisms (SNPs) in human/mouse lncRNAs. hp:/ SNP/ (Gong et al., 2014) DISEASE ASSOCIATION DATABASE 17 LncRNADisease A database for long-noncoding RNA-associated diseases. hp:/ (Chen et al., 2013a) 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd circRNA数据库 更好地注释更好地注释，更好地分析更好地分析，更好的结果 更好的结果 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd lncRNA数据分析研究Unknown 新新circRNA预测 预测 新新lncRNA预测 预测 Haas & Zody, Nature biotechnology, 2010 Transcriptome Reconstruc5on 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd lncRNA数据分析研究Unknown 新新circRNA预测 预测 新新lncRNA预测 预测 1. Coding PotentialCoding Probability 200bp (Definition of lncRNAlncRNA) ) 3. Exon Number 2 Optional 3. Exon Number 2 Optional 过滤已知lncRNA 预测新的lncRNA RACE扩增新 lncRNA测序 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd 新新circRNA预测 预测 新新lncRNA预测 预测 circRNA数据分析研究Unknown 1.1. 可以发现新的可以发现新的 circRNAcircRNA的外显子连的外显子连 接形式接形式 2.2. 可以发现新的可以发现新的 circRNAcircRNA存在区域存在区域 （IntergenicIntergenic或者或者 IntronIntron区域区域） Iju Chen. Wiley Interdiscip Rev RNA 2016 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd circRNA数据分析研究Unknown 新新circRNA预测 预测 新新lncRNA预测 预测 ACFS FROM Xin5an You, Nature Neuroscience, 2016 1.1. Achieve the unmapped reads Achieve the unmapped reads 寻找潜在的circRNA的序列 2.2. Segmentation of the reads Segmentation of the reads 将序列片段化后，寻找片段化后能部 分比对到基因组的序列 3.3. Identification of the Identification of the circRNAcircRNA 寻找前端在RNA后端，后端在RNA 的前端的序列 4.4. ExpressionExpression将序列比对回circRNA的转录本后重新统计表达量 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd 烈冰circRNA数据分析案例 新新circRNA预测 预测 新新lncRNA预测 预测 circRNA分类 分类 circRNA长度 长度 circRNA表达特异性 表达特异性 Circular RNA profi ling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging mulOple miRNAs 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd 研究策略 测序 测序 质量控制 质量控制 序列比对 序列比对 预测新预测新lncRNA 预测新预测新circRNA 得到已知得到已知lncRNA ncRNA对功能影响 对功能影响 ncRNA作用机制推测 作用机制推测 circRNA/lncRNA 功能预测 功能预测 得到已知得到已知circRNA 新序列预测 新序列预测 测序数据处理 测序数据处理 数据库功能推测 数据库功能推测 实验验证 实验验证 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd 核内核内ncRNAsncRNAs的功能 的功能 胞质胞质ncRNA 核内核内ncRNA 充当增强子充当增强子enhancer (eRNA)招募招募RNA 聚合酶聚合酶 II 招募染色质修饰复合物 招募染色质修饰复合物 影响转录因子的招募 影响转录因子的招募 影响染色体的空间构象 影响染色体的空间构象 影响影响RNA的剪接 的剪接 影响影响mRNA的稳定性 的稳定性 影响影响mRNA的翻译速率 的翻译速率 作为作为ceRNA竞争性结合竞争性结合microRNA 部分部分lncRNA具有的短具有的短ORF，可以翻译成小肽 可以翻译成小肽 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd 常见常见circRNAcircRNA分析方案分析方案烈冰出品 烈冰出品 circRNA鉴定及统计 鉴定及统计 circRNA-Sponges分析 分析 circRNA-mRNA共表达分析 共表达分析 核心核心circRNA解析 解析 核心核心circRNA验证 验证 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd circRNA鉴定及统计 鉴定及统计 circRNA-Sponges分析 分析 circRNA-mRNA共表达分析 共表达分析 核心核心circRNA解析 解析 核心核心circRNA验证 验证 常见常见circRNAcircRNA分析方案分析方案烈冰出品 烈冰出品 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd circRNA鉴定及统计 鉴定及统计 circRNA-Sponges分析 分析 circRNA-mRNA共表达分析 共表达分析 核心核心circRNA解析 解析 核心核心circRNA验证 验证 常见常见circRNAcircRNA分析方案分析方案烈冰出品 烈冰出品 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd circRNA鉴定及统计 鉴定及统计 circRNA-Sponges分析 分析 circRNA-mRNA共表达分析 共表达分析 核心核心circRNA解析 解析 核心核心circRNA验证 验证 常见常见circRNAcircRNA分析方案分析方案烈冰出品 烈冰出品 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd circRNA鉴定及统计 鉴定及统计 circRNA-Sponges分析 分析 circRNA-mRNA共表达分析 共表达分析 核心核心circRNA解析 解析 核心核心circRNA验证 验证 常见常见circRNAcircRNA分析方案分析方案烈冰出品 烈冰出品 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd circRNA鉴定及统计 鉴定及统计 circRNA-Sponges分析 分析 circRNA-mRNA共表达分析 共表达分析 核心核心circRNA解析 解析 核心核心circRNA验证 验证 常见常见circRNAcircRNA分析方案分析方案烈冰出品 烈冰出品 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd circRNA鉴定及统计 鉴定及统计 circRNA-Sponges分析 分析 circRNA-mRNA共表达分析 共表达分析 核心核心circRNA解析 解析 核心核心circRNA验证 验证 常见常见circRNAcircRNA分析方案分析方案烈冰出品 烈冰出品 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd lncRNA功能预测 功能预测 ncRNA基因组位置分析 基因组位置分析 lncRNA-protein互作分析 互作分析 lncRNA-TF互作分析 互作分析 ncRNA可变剪接分析 可变剪接分析 共表达分析 共表达分析 ncRNAncRNA数据分析研究数据分析研究其他分析内容 其他分析内容 lncRNAlncRNA- -蛋白互作研究 蛋白互作研究 lncRNAlncRNA功能推测 功能推测 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd ncRNAncRNA数据分析研究数据分析研究其他分析内容 其他分析内容 lncRNA功能预测 功能预测 ncRNA基因组位置分析 基因组位置分析 lncRNA-protein互作分析 互作分析 lncRNA-TF互作分析 互作分析 ncRNA可变剪接分析 可变剪接分析 共表达分析 共表达分析 lncRNAlncRNA- -蛋白互作研究 蛋白互作研究 lncRNAlncRNA功能推测 功能推测 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd 电话网址： lncRNA Protein Gene Gene Gene Gene Interac5on TF ncRNAncRNA数据分析研究数据分析研究其他分析内容 其他分析内容 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd lncRNA功能预测 功能预测 ncRNA基因组位置分析 基因组位置分析 lncRNA-protein互作分析 互作分析 lncRNA-TF互作分析 互作分析 ncRNA可变剪接分析 可变剪接分析 共表达分析 共表达分析 lncRNAlncRNA- -蛋白互作研究 蛋白互作研究 lncRNAlncRNA功能推测 功能推测 ncRNAncRNA数据分析研究数据分析研究其他分析内容 其他分析内容 2010-2016 Novel Bio Co.,Ltd lncRNA功能预测 功能预测 ncRNA基因组位置分析 基因组位置分析 lncRNA-protein互作分析 互作分析 lncRNA-TF互作