课题3　分解纤维素的微生物的分离 (15).ppt

温故而知新,1.实验室常用的消毒和灭菌的方法分别有哪些？,煮沸消毒法巴氏消毒法：化学药剂消毒法：紫外线消毒。,.常用的消毒方法：,.常用的灭菌方法,灼烧灭菌干热灭菌：高压蒸气灭菌：,2.微生物的接种最常用的是什么方法？,平板划线法稀释涂布平板法,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。,3.实验室中微生物的筛选原理：,4.用什么样的培养基分离分解尿素的细菌？,用以尿素为唯一氮源的选择培养基来分离分解尿素的细菌。,课题3分解纤维素的微生物的分离,简述纤维素酶的种类及作用，从土壤中分离出分解纤维素的微生物，讨论这些微生物的应用价值。,从土壤中分离分解纤维素的微生物,一、课题目标：,二、课题重点和难点：,1、课题重点,2、课题难点,从土壤中分离分解纤维素的微生物,纤维素与纤维素酶,1.纤维素,纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。,一、基础知识,植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。其中棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。,土壤中某些微生物能够产生纤维素酶,把纤维素分解为葡萄糖，后再利用。,纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%-60%能被土壤中能产生纤维素酶的微生物所利用，不会大量积累。,在草食性动物等的消化道内，也共生有分解纤维素的微生物，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素的能力。,人类可应用分解纤维素的微生物将秸秆等废弃物转变成酒精，用纤维素酶处理服装面料等。,2、纤维素酶的组成及作用？,纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即和，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。,葡萄糖苷酶,C1酶、Cx酶,取二支20mL的试管,3、实验：纤维素酶分解纤维素的实验,各加入一张滤纸条,各加入pH4.8，物质量为0.1mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液11ml和10ml,甲乙,在乙试管中加入1mL纤维素酶,两支试管固定在锥形瓶中，放在140r/min的摇床上振荡1h,结果：乙试管的滤纸条消失,讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？,滤纸崩溃法,提示：本实验的自变量是纤维素酶的有无，自变量的操纵方法是：在一支试管中添加适量（1mL）的纤维素酶溶液，在另一支试管不添加纤维素酶，但需加入等量的缓冲液，不能加入蒸馏水，否则会影响溶液的pH。,实验分析：P27的小实验是如何构成对照的？,（二）纤维素分解菌的筛选,1、筛选纤维素分解菌的方法是_。该方法可以通过_反应直接对微生物进行筛选。,刚果红染色法,颜色,阅读课本课本28页相关部分，回答下列问题：,2、筛选原理是：刚果红可以与纤维素形成_，当纤维素被_分解后，红色复合物无法形成，出现以_为中心的_，我们可以通过_来筛选纤维素分解菌。,红色复合物,纤维素酶,纤维素分解菌,透明圈,是否产生透明圈,土壤取样,选择培养,梯度稀释,将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上,挑选产生透明圈的菌落,（操作流程）,（此步可省略）,二、实验设计,操作步骤,【土壤取样】,采集土样时，应选择富含纤维素的环境。,将滤纸埋于深约10cm的腐殖土壤中。30天后从腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。,1、为什么要在富含纤维素的环境中找纤维素分解菌？,2、将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？,人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境，使纤维素分解菌相对聚集。将纸埋于深约10cm的腐殖土壤中。,思考？,在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高,1、实验流程中“选择培养”的目的是什么？,其目的是增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。,【选择培养】,阅读资料二“选择培养基”回答问题,培养基成分分析,分析旁栏中的培养基配方，回答以下几问题：,思考？,2、制备选择培养基,1）、纤维素分解菌选择培养基属于_（固体、液体）培养基，原因是_,液体,没有添加琼脂成分,2）、该培养基对微生物_（具有，不具有）选择作用。如果具有，其选择机制是_。,具有,以纤维素粉为主要碳源，能分解纤维素的微生物可以大量繁殖,若设置一个对照实验说明选择培养的作用，应控制的变量是将_改为_。或用培养基与之对照,3）、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用？,葡萄糖,纤维素粉,牛肉膏蛋白胨,说明：分析“纤维素分解菌的选择培养基配方”可知，该配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。,3、具体操作：,将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养12天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养,在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用,旁栏思考4为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？,按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释101106倍。,【梯度稀释】,将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上,制备培养基:,参照课本旁栏中的比例配制,鉴别纤维素分解菌的培养基,倒平板操作。,涂布平板：,将稀释度为104106的菌悬液各取0.1ml涂布到平板培养基上，30倒置培养。,参照课本刚果红染色法，挑选产生透明圈的菌落,即为分解纤维素的菌落.,挑选产生透明圈的菌落,【资料三】刚果红染色法,方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应,方法二：在倒平板时就加入刚果红,两种常用刚果红染色法的比较,显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌产生的,操作简便，不存在菌落混杂问题,操作繁琐。刚果红会使菌落之间发生混杂,1.产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈2.有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。,配制CR溶液（质量浓度为10mg/mL）灭菌按照1mLCR溶液/200mL培养基的比例混匀倒平板培养产生透明圈,培养长出菌落覆盖CR溶液（质量浓度为1mg/mL）倒出CR溶液加入Nacl溶液(物质的量浓度为1mg/L)倒掉Nacl溶液产生透明圈,方法一中NaCl溶液的作用？,漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。,思考？,思考：本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？,本实验流程与课题2的流程的区别如下。课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。,三、操作提示,（一）复习微生物技术,（二）选择培养的操作方法,选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等等。,生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境,1、取样的环境是怎样的，作出这种选择的理由是什么？,四、结果分析与评价,2.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落？对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。3.分离的结果是否一致由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。,五、课题延伸,本课题对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选，但是这只是分离纯化的第一步。为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行的实验，纤维素酶的发酵方法有发酵和发酵。纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的进行定量的测定。,发酵产纤维素酶,液体,固体,葡萄糖,1、（2013新课标）（15分）临床使用抗生素前，有时需要做细菌耐药实验。实验时，首先要从病人身上获取少量样本，然后按照一定的实验步骤操作，以确定某致病菌对不同抗生素的敏感性。回答下列问题：（1）为了从样本中获取致病菌单菌落，可用法或法将样本接种于固体培养基表面，经过选择培养、鉴别等步骤获得。（2）取该单菌落适当稀释，用法接种于固体培养基表面，在37培养箱中培养24h，使其均匀生长，布满平板。,划线,稀释涂布（或涂布,涂布,高考回顾,（3）为了检测该致病菌对于抗生素的敏感性，将分别含有A、B、C、D四种抗生素的滤纸片均匀至于该平板上的不同位置，培养一段时间后，含A的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病菌对抗生素A；含B的滤纸片周围没有出现透明圈，说明该致病菌对抗生素B；含C的滤纸片周围的透明圈比含A的小，说明；含D的滤纸片周围的透明圈也比含A的小，且透明圈中出现了一个菌落，在排除杂菌污染的情况下，此菌落很可能是抗生素D的。（4）根据上述实验结果，为达到抗菌目的，最好应选用抗生素。,敏感,不敏感,该致病菌对C的敏感性比对A的弱,耐药菌,A,2（2013四川卷）由于酵母菌直接利用淀粉的能力很弱，有人将地衣芽孢杆菌的-淀粉酶基因转入酵母菌中经筛选得到了可高效利用淀粉的工程酵母菌菌种（过程如图甲所示）。,（1）图甲中，过程需要的酶有_。为达到筛选目的，平板内的固体培养基应以_作为唯一碳源。、过程需要重复几次，目的是_。,进一步筛选纯化获得分解淀粉能力强的酵母菌,限制性核酸内切酶、DNA连接酶,淀粉,（2）某同学尝试过程的操作，其中一个平板经培养后的菌落分布如图乙所示。该同学的接种方法是_；推测该同学接种时可能的操作失误是_。,（3）以淀粉为原料，用工程酵母菌和普通酵母菌在相同的适宜条件下密闭发酵，接种_菌的发酵罐需要先排气，其原因是_。,稀释涂布平板法,涂布不均匀,工程菌分解淀粉产生葡萄糖的能力强，导致酒精发酵产生CO2的速率更快,工程酵母,分解纤维素的微生物的分离,纤维素酶,种类、作用,刚果红染色,筛选原理,实验设计,土壤取样,选择培养,涂布培养,纯化培养,前置染色法后置染色法,富含纤维素土壤,增大分解菌含量,染色鉴别,分离出分解菌,六、课堂总结,操作提示,课题延伸,结果分析与评价,复习微生物技术,选择培养的操作方法,环境特点，取样理由,培养基是否合格，是否筛选出菌落,分离结果是否一致,发酵产纤维素酶实验鉴定,练一练：,1.下列关于纤维素酶的说法，错误的是,A.纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种B.纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖C.纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁D.葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖,D,2.利用刚果红染色法可以筛选出纤维素分解菌，下列说法错误的是,A.刚果红能与纤维素形成红色复合物B.刚果红能与纤维二糖形成红色复合物C.刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物D.若培养基上产生了透明圈，则说明已筛选出了纤维素分解菌,B,练一练：,3、在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌，符合下列哪一生物学观点？（）A、生物结构与功能相适应的观点B、生物结构与功能整体性观点C、生物与环境相适应的观点D、生物发展进化的观点,C,练一练：,练一练,4、从土壤中分离获得某种微生物的步骤是（）土壤取样梯度稀释选择培养菌悬液涂布平板挑选出单个菌落A、B、C、D、,B,练一练,5、有关选择培养正确的叙述是（）,A、可以增加纤维素分解菌的浓度B、可以减少纤维素分解菌的浓度C、所用培养基是固体培养基D、所用培养基是平板培养基,A,作业1：完成下列表格,作业2:课时练26页增效作业题,将细菌涂布在只有尿素为唯一氮源的选择培养