第五章 体内药物分析VIP

.,药物分析,第五章体内药物分析,熟悉：体内样品的采集与制备方法体内样品分析方法验证的技术要求,了解：体内药物分析的性质与意义,掌握：体内药物分析的特点和应用体内样品处理体内样品分析方法验证的内容,概述,体内药物分析,生物分析,4,方法建立与验证,净化与浓集,原形、代谢物,体液或组织,色谱、免疫分析、生物完整、部分和交叉验证,原形药物或其代谢物缀合物、蛋白结合物,体内样品,存在形式,样品制备,分析方法,蛋白沉淀、萃取、膜分离水解、化学衍生化,血液是最常用样品尿液、唾液、头发和脏器,体内药物分析的特点主要来自于体内样品的特点,特点,1.体内样品的特点（1）采样量少：mll级；且不易重新获得（2）待测物浓度低：g/mlng/ml级，甚至pg/ml（3）干扰物质多：尤其是血样和组织中的蛋白质,2.体内药物分析的特点（1）样品需经分离与浓集，或化学衍生化处理（2）对分析方法的灵敏度及选择性要求较高（3）分析工作量大，数据处理和结果阐明繁杂,第一节常用体内样品的制备与储存,一、体内样品的种类,体液,组织,排泄物,血液、唾液脑脊液、胃液、胆汁、乳汁、精液、泪液,尿液粪便、汗液,胃、肠、肝、肾、肺、脑、肌肉、头发,体内样品,二、体内样品的采集与制备,1.血样的采集静脉，0.25ml，15%20%动物总血量2.血浆的制备抗凝剂，1000g离心510分钟，淡黄色上清液3.血清的制备30分钟1小时，1000g离心，510分钟，上层淡黄色液体4.全血的制备抗凝剂，不离心,血样,50%60,20%40,常见体内样品,1.尿样的特点原形或代谢物药物浓度较高收集量大（15L）2.尿样的采集自然排尿规定时间段（68小时）（时间尿）3.尿样的储存加入适当防腐剂,尿样,TDM（治疗药物监测）测定S（唾液浓度）代替P（血浆游离浓度）进行临床监测1.唾液的组成腮腺、舌下腺和颌下腺2.唾液的采集漱口15分钟，安静状态，自然流出的唾液物理或化学方法刺激3.样品的制备3000r/min离心10分钟，上清液,唾液,1.样品的制备制成水性基质匀浆溶液2.样品的处理（1）沉淀蛋白法（2）酸/碱水解法（3）酶水解法蛋白水解酶中的枯草菌溶素,组织,三、体内样品的储存与处理,短期保存：冰箱（4）冷藏长期保存：冷柜（-20/-70-80）冷冻，小体积分装1.血浆/血清分离（2小时），硬质玻璃/聚乙烯管（EP），冷冻2.尿样冷藏（2436小时）加防腐剂3.唾液冷冻保存时，解冻后充分搅匀后再用,（一）冷藏与冷冻,采样后立即终止酶的活性常用方法：液氮速冻，微波照射，匀浆及沉淀，加酶活性阻断剂（氟化钠）或抗氧剂（维生素C），调节pH及样品煮沸,（二）去活性,酯酶是普遍存在于全血、血浆和血清中的一类水解酶，能够水解结构中含有酯键的药物,羧酸酯酶,乙酰胆碱酯酶,磷酸二酯酶,芳香基酯酶,丁酰胆碱酯酶,去活性：酶活性阻断剂,酯类,酰胺类,内酰胺类,内酯类,葡糖苷酸类,调节pH有效避免化合物发生降解或者分子内转化,甲酸、醋酸、磷酸、枸橼酸或者缓冲盐溶液,去活性：调节pH,测定利福平时加入0.5%w/v的维生素C,测定左旋多巴及其代谢产物时加入焦亚硫酸钠和乙二胺四乙酸（EDTA）,含有酚羟基结构的药物在生物基质或样品处理过程易发生自身氧化使用抗氧化剂为常用的方法,去活性：抗氧化剂,第二节体内样品处理,分析方法与样品处理步骤的选择,样品处理（分离、浓集、改性）为药物的测定创造良好条件样品处理是体内药物分析过程中重要且繁复的工作,一、体内样品处理的目的,仪器污染，劣化（去蛋白）提高测定灵敏度/选择性化学改性（衍生化）,血浆蛋白结合物、缀合物使待测药物/代谢物释放测定药物/代谢物总浓度,1.使待测组分游离,2.满足测定方法的要求,3.改善分析环境,样品介质组成复杂：分离待测组分浓度低：浓集,样品处理,二、常用体内样品处理方法,蛋白沉淀法,分离与浓集法,缀合物水解法,（一）,（二）,（三）,化学衍生化法,（四）,（一）去除蛋白质法,加入与水混溶的有机溶剂，蛋白析出，药物释放乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃等血浆/血清与有机溶剂的体积比1（23）,饱和硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠等血清与饱和硫酸铵溶液的体积比为12,1.溶剂沉淀法,2.中性盐析法,10%三氯醋酸或6%高氯酸溶液血清与强酸的体积比10.6上清液呈强酸性（pH4）酸性下分解的药物不宜用,热变性蛋白质沉淀通常90方法简单只能除去热变性蛋白待测物热稳定性良好,3.强酸沉淀法,4.热凝固法,（二）分离与浓集法,液相萃取法,固相萃取法,超滤法,1.,2.,3.,1.液相萃取法,溶剂的选择原则,溶剂的用量,水相的pH,（1）,（2）,（3）,提取操作,（4）,（1）溶剂的选取原则,1）对药物分子未电离形式可溶，对电离形式不溶；2）沸点低，易挥发；3）与水不相混溶；4）无毒，不易燃烧；5）具有化学稳定和惰性；6）不影响紫外检测,1）辅助试剂的使用乙醚萃取可混入约1.2%水：加入固体氯化钠2）混合溶剂的使用正己烷-异丙醇（955）,*：含过氧化物；：肝脏毒性，有致癌作用,（2）溶剂的用量,有机相与水相（样品）体积比为1151,碱性药物pH高于pKa12pH单位酸性药物pH低于pKa12pH单位碱性药物在碱性pH，酸性药物在酸性pH基质中提取；多在碱性下提取，可减少内源性物质（酸性）的干扰碱性下不稳定，在中性用三氯甲烷和异丙醇提取,（3）水相的pH,一般只提取1次若提取回收率较低（低于50%），提取23次脂溶性干扰物，可进行小体积水溶液反提取,（4）提取操作,2.固相萃取法,固相萃取法的原理,固相萃取法操作步骤,注意事项,（1）,（2）,（3）,固相萃取法的特点,（4）,自动化固相萃取,（5）,（1）固相萃取法的原理,含药物体内样品通过小柱时，受到“吸附”、“分配”、“离子交换”或其他亲和力作用，药物及内源性物质同时被保留在固定相（填料）上洗脱方式有两种：药物比干扰物质与固定相之间的亲和力更强：冲洗溶剂洗去干扰物时药物被保留，然后再用对药物亲和力更强的溶剂洗脱药物；干扰物质较药物与固定相之间的亲和力更强：药物直接被洗脱，干扰物被保留,（2）固相萃取法操作步骤,第1步：甲醇润湿小柱，活化填料；净化填料第2步：水/缓冲液冲洗小柱，去除甲醇；甲醇含量过低（低于5%）致C18链弯曲折叠，回收率降低第3步：加样，使样品通过小柱，并弃去滤过液,平衡,平衡,第4步：水/缓冲液冲洗小柱，去除内源性及其他干扰物质第5步：洗脱溶剂洗脱待测物，收集洗脱液,（3）注意事项,1）体液样品（如血浆等）通过萃取柱的流速在12ml/min；2）冲洗液和洗脱剂的强度与用量适当，否则导致药物损失/选择性下降，通常选用可与水混溶的洗脱剂；3）萃取碱性药物时，洗脱剂中常加酸、有机胺、氨水、醋酸铵或离子对试剂,（4）固相萃取法的特点,当采用亲脂性键合硅胶SPE时方便、省时通常可以用小体积的甲醇、乙腈等洗脱剂（200300l）完全洗脱药物，净化并浓集样品不需蒸干即可直接进样,（5）自动化固相萃取法,对于单个样品处理，SPE操作省时对于大量样品的处理半自动SPE：萃取过程机械化全自动化仪器：通过柱切换技术实现固相萃取与HPLC联用,柱切换：固相萃取-LC/MS/MS,（5）自动化固相萃取法,3.超滤法,ultrafiltration是一种膜分离技术按照截留分子量，选择半透膜，可分离301000kD的可溶性生物大分子无化学试剂，无相变化,简便，游离药物分析的首选方法；尤其适合TDM,（三）缀合物水解法,简便，快速水解过程中发生药物分解专一性较差,葡萄糖醛酸苷酶或（和）硫酸酯酶专属性强时间较长可引入黏蛋白,溶剂萃取过程中缀合物（尤其硫酸酯）直接分解,测定尿药总量、水解缀合物或相代谢产物趋向于直接测定缀合物,1.酸水解法,2.酶水解法,3.溶剂解法,（四）化学衍生化法,药物分子中含有活泼氢者均可被化学衍生化，如含有R-COOH、R-OH等官能团的药物GC：提高药物的挥发性；增加药物的稳定性；生成非对映异构体HPLC：提高检测灵敏度；改善色谱分离,化学衍生化,1.在GC中的应用（1）硅烷化：三甲基硅烷（TMCS）（2）酰化：三氟乙酸酐（TFAA）（3）烷基化：碘庚烷（C7H15I）（4）不对称衍生化：（S）-N-三氟乙酰脯氨酰氯（ST-FPC）,2.在HPLC中的应用（1）衍生化的分类柱前/柱后；在线/离线（2）衍生化方法1）紫外衍生化2）荧光衍生化3）质谱检测衍生化4）非对映体衍生化,第三节体内样品分析方法与方法验证,一、分析方法的建立,二、分析方法的验证,一、分析方法的建立,分析方法的选择,分析方法建立的一般程序,（一）,（二）,（一）分析方法的选择,HPLC，GCLC-MS、LC-MS/MS、GC-MS内源性物质、大多数小分子及部分生物大分子药物的药代动力学,常用的检测方法：色谱分析法、免疫分析法和生物学方法,色谱分析法,RIA、EIA、FIATDM及生物大分子的药代动力学应用较多,抗生素生物利用度、生物等效性、TDM微生物学方法一般特异性较差应用较少，可用于抗生素类药物的分析,免疫分析法,生物学方法,（二）分析方法建立的一般程序,待测物、内标（必要时）的对照标准物色谱柱（填料）、流动相、流速、进样量,分析方法的建立和验证过程系同步进行为便于讨论，以色谱分析法为例分别叙述,1.色谱条件的筛选,试剂与溶剂试验生物基质试验质控样品试验,代谢产物对待测物、内标物的干扰配伍用药的干扰,2.色谱条件的优化,3.试验样品的测试,二、分析方法的验证,选择性,标准曲线与定量范围,定量下限,（一）,（二）,（三）,精密度与准确度,（四）,样品稳定性,（五）,提取回收率,（六）,基质效应,（七）,试验样品分析,试验样品浓度超出定量范围的处理,作为外源性药物使用的内源性物质的测定,（八）,（九）,（十）,微生物/免疫学方法的验证,（十一）,名词解释,（十二）,（一）选择性,比较待测物的对照标准物质与6个不同个体的空白生物基质和QC样品软电离质谱（LC-MS或LC-MS/MS）基质效应,比较QC样品和至少6个不同个体用药后的试验样品必要时HPLC-DAD和LC-MS确证峰的单一/同一性,选择性（selectivity），体内样品所含其他物质不得干扰对样品的测定或者其干扰在分析方法的可接受范围内。,1.内源性物质,2.未知代谢物,比较待测药物、同服药物、待测药物的QC样品和添加有同服药物的干扰样品,3.同服药物,4.参比方法,参比方法横坐标（x），拟定方法纵坐标（y），最小二乘y=a+bxa表示受到恒定干扰的程度b表示受到比例干扰的程度（如，标记抗原不纯，交叉免疫）,（二）标准曲线与定量范围,少数方法（如，IA）外，通常为线性模式线性回归：最小二乘法或加权最小二乘法自变量（x）为药物浓度，因变量（y）为分析物与内标的响应信号强度比值；定量范围由分析物的定量下限和上限决定。,1.标准曲线的建立,（二）,（1）工作溶液：n6（不包括0点）；通常为1001000倍（2）内标溶液（3）系列校正标样：空白生物基质，加入工作溶液（4）标准曲线的绘制：药物浓度，以单位体积（如血浆）或质量（如肝脏）的生物基质中加入分析物对照标准物质的量表示,2.限度要求,通常用至少6个浓度建立标准曲线非线性相关（如IA）可能需要更多浓度点定量范围覆盖全部待测样品浓度范围定量上限（ULOQ）应高于用药后的峰浓度（Cmax）定量下限（LLOQ）应低于Cmax的10%5%（1/101/20）,标准曲线各浓度点的回归计算值（x）与标示值（x）之间的偏差bias=（x-x）/x100%在可接受的范围之内最低浓度点的偏差在20%以内其余浓度点的偏差在15%以内,（三）定量下限,定量下限（LLOQ）：标准曲线上的最低浓度点符合准确度和精密度要求,1.测定法,取同一生物基质，配制至少5个独立的质控样品，其浓度应使信噪比（S/N）大于5，依法进行精密度与准确度验证,2.限度要求,准确度应在标示浓度的80%120%范围内，相对标准差（RSD）应小于20%,（四）精密度与准确度,方法精密度除评价批内（日内）RSD外，同时还应评价批间（日间）RSD,1.测定法,高、中、低及定量下限4个浓度的QC样品，每个浓度配制并测定至少5个样品低：不高于LLOQ的3倍；高：约ULOQ的75%；中：几何平均浓度至少3个分析批，且至少两天进行测定,2.限度要求,准确度：定量下限，80%120%；低、中、高，85%115%RSD：定量下限，20%；低、中、高，15%,（五）稳定性,短期稳定性：分析物和内标的储备液和工作溶液及QC样品从冰箱储存条件到室温或样品处理温度下短期放置的稳定性，QC样品的冷冻和融化稳定性，以及处理过的样品在自动进样器温度下的稳定性长期稳定性：QC样品在冰冻（20或80）条件下，分析物和内标的储备液和工作溶液在特定温度（如4或20）下以及不同存放时间进行稳定性评价,1.测定法（高低浓度）,室温考察应不超过1个工作日（如1、2、4、8或24小时）冷藏（4）应考察数个工作日（标准储备液至整个分析完成）冷冻（-20/-80）至整个分析完成，可能需数星期甚至数月冻-融至少经历3个循环,2.期限要求,短期：通常1工作日，不超过3工作日；长期：整个分析完成期限,（六）提取回收率,1.测定法,高、中、低3个浓度的QC样品，每一浓度配制至少5个样品另取空白生物基质，照QC样品同法处理，加入等量的标准溶液（必要时除去溶剂）同法处理高、中、低3个浓度的对照品标准溶液（不含生物基质）,样品处理方法的评价重点在于结果的精密与重现；而非待测物提取的完全与否,2.限度要求,在药代动力学和生物利用度研究中，高、中、低3个浓度的提取回收率应一致、精密和可重现。,（七）基质效应,当采用质谱为检测器的LC-MS或LC-MS/MS技术进行样品分析检测时，由于待测物的离子化效率（电喷雾电离，ESI）易受样品中的基质成分的影响，应该考察基质效应（matrixeffect）。,1.测定法使用至少6批来自不同供体的空白基质。对于每批基质，应该通过计算基质存在下的峰面积，与不含基质的相应峰面积比值，计算每一分析物和内标的基质因子。进一步通过分析物的基质因子除以内标的基质因子，计算经内标归一化的基质因子。2.限度要求从6批基质计算的内标归一化的基质因子的变异系数不得大于15%。该测定应分别在低浓度和高浓度下进行。,（八）试验样品分析,分析方法验证完成以后开始每个试验样品一般测定一次，必要时可进行复测。每个分析批体内样品测定时应建立新的批标准曲线随行测定高、中、低3个浓度的QC样品。每个浓度至少双样本，并应均匀分布在试验样品测试顺序中。当一个分析批内试验样品数目较多时，应同时增加各浓度QC样品数，使QC样品数大于试验样品总数的5%。QC样品测定结果的偏差一般应不大于15%。最多允许1/3的QC样品结果超限，但不能出现在同一浓度QC样品中。,（九）试验样品浓度超出定量范围的处理,标准曲线不能外延，浓度超出定量范围的样品应进行处理后再测定浓度高于ULOQ部分样品用空白生物基质稀释至规定体积再测定同时配制浓度高于ULOQ的QC样品，同法稀释（浓度不低于LLOQ）后测定浓度低于LLOQ在必要时，可通过改变分析方法的定量范围，降低LLOQ的浓度，进行部分验证，从而获得其浓度值,（十）作为外源性药物使用的内源性物质的测定,对生物基质进行处理生物基质通过活性炭滤过、透析等技术去除所含的该内源性物质后，作为空白生物基质使用使用不含内源性物质的生物基质适用于生物参数呈周期性变化的内源性物质（如雌激素）,使用替代基质如兔血浆、人血清蛋白、缓冲液、0.9氯化钠溶液等；测得的浓度需进行校正采用标准加入法适用于内源性物质含量较低的药物；结果为总浓度,（十一）微生物学/免疫学方法的验证,微生物学或免疫学分析法的标准曲线本质上是非线性的，应尽可能采用更多的浓度点建立标准曲线如果重复测定能够改善准确度，则应在方法验证和未知样品测定中采用同样的步骤微生物学或免疫学分析方法验证实验应包括在几天内进行的6个分析批，每个分析批应包括3套质控样品且每套含5个浓度（LLOQ、低、中、高浓度及ULOQ）的质控样本,（十二）名词解释1,对照标准物质（referencestandard）：用于配制校正标样和QC样品的待测物的参比标准在结构上可以是待测物本身，也可以是其游离碱或酸，盐或酯常用的对照标准物质主要有三种来源：法定对照标准物质（如ChP标准品或对照品、USP标准品）；市售对照标准物质（来自于具有良好信誉的供应商）；分析实验室或科研机构自行合成和（或）纯化的具有一定纯度的化合物,生物基质（biologicalmatrix）：生物来源的物质，能以可重复的方式采集和处理；如血浆、血清、尿、粪、各种组织等,（十三）名词解释2,基质效应（matrixeffect）：样品中存在除待测物以外的其他干扰物质对响应造成的直接或间接的影响校正标样（calibrationstandard）：在空白生物基质中加入已知量待测物对照标准物质制成的样品用于建立标准曲线，计算质控（QC）样品和试验样品中待测物的浓度,质控样品（qualitycontrolsample）：即QC样品，在空白生物基质中加入已知量待测对照物标准物质制成的样品用于监测生物分析方法的效能和评价每一分析批中试验样品分析结果的完整性和正确性,（十四）名词解释3,试验样品（studysamples）是作为分析对象的体内样品处理过的样品（processedsample）待测样品经过各步骤（如提取、纯化、浓缩等）处理制成的、直接用于仪器分析的试样分析批（Analyticalrun/batch）包括试验样品、适当数目的校正标样和QC样品的一个完整系列。由于仪器性能的改善和自动进样器的使用，一天内可以完成几个分析批，一个分析批也可以持续几天完成，但连续测量不宜超过3天,试验样品再分析（incurredsamplereanalysis）分析一部分已测试验样品，来评价原来的试验样品测定的结果是否可以重现,第四节典型体内药物分析应用,1.LC-MS/MS测定人血浆中氨氯地平对映体及其药物动力学应用,2.替诺福韦双特戊酯的体内药动学及其对左卡尼汀血药浓度的影响,氨氯地平新型二氢吡啶类长效钙通道阻滞药，临床上主要用于治疗高血压和心绞痛氨氯地平分子结构中含有一个手性碳原子，故具有一对光学异构体R-（+）-氨氯地平与S-（-）-氨氯地平仅S-（-）-氨氯地平具有血管扩张作用因此需进行血浆中氨氯地平对映体的手性分离与立体选择性药动学研究,一、LC-MS/MS测定人血浆中氨氯地平对映体及其药物动力学应用,色谱条件色谱柱ChiralcelOJRH柱（150mm4.6mm，3.5m）；流动相乙腈-0.2%氨的水溶液（8020，v/v）；流速1.0ml/min；进样10l质谱条件离子化方式，电喷雾（ESI）离子源；电离模式，正离子；扫描方式，多反应监测（MRM）。氨氯地平和氨氯地平-d4（内标物）的母/子离子对的质荷比（m/z）分别为409.2238.1和413.2238.1,200l血浆样品中加入一定量内标溶液混匀，再加入乙酸乙酯-正己烷（82，v/v）溶液2.0ml,血浆样品处理,振荡2分钟,3000r/min离心5分钟,取有机层溶液1.8ml，40氮气吹干，加入500l流动相复溶,方法学验证选择性：在实验条件下两对映体色谱峰达基线分离，内源性物质不干扰测定,血浆中氨氯地平LC-MS/MS分析物（左）和内标物（右）的典型MRM色谱图a.空白人血浆；b.人血浆中加入内标物；c.空白人血浆中加入定量下限浓度的分析物（0.10ng/ml）和内标物；d.其中一位受试者口服10mg氨氯地平片后8小时采集的试验样品,方法学验证定量范围：氨氯地平单个对映体浓度在0.110ng/ml范围内，均有良好的线性响应（r0.995）准确度和精密度：定量下限及低、中、高浓度质控样品（0.1、0.3、5.0和8.0ng/ml）的准确度在97.9%103%之间，各项精密度实验结果的RSD均小于6.96%,提取回收率：R-（+）-氨氯地平的低、中、高浓度质控样品回收率分别为（78.643.93）%、（69.623.20）%和（76.532.39）%S-（-）-氨氯地平的低、中、高浓度质控样品回收率分别为（79.422.05）%、（79.332.80）%和（78.742.50）%内标R-/S-氨氯地平-d4回收率分别为（70.515.62）%和（72.632.63）,样品稳定性：低、高质控样品分别在室温放置8小时，经过三次冻融循环，-20保存30天以及处理过的样品在自动进样器温度下放置4小时的稳定性评价，每个浓度的均值与标示浓度的偏差均在15%内，满足分析方法要求。,稀释可靠性：将浓度为50ng/ml和100ng/ml的质控样品用空白基质分别稀释5倍和10倍以评价稀释可靠性，每个稀释倍数各采用6个平行样品，各稀释倍数条件下的质控样品测得值的准确度（100%15%内）和精密度（15%）均满足分析方法的接受标准，表明样品在进行同样倍数的稀释不影响分析方法的准确度和精密度。,试验样品再分析：分别从每个受试者样品中选择3个Cmax附近样品（4、5和7小时）及2个消除相样品（16和24小时）进行试验样品再分析。共30个试验样品进行再分析，结果原始分析测得的浓度和重新分析测得的浓度之间的差异在两者均值的20%范围内，满足分析方法要求。,药物动力学结果采用非房室模型方法计算获得药物动力学参数R-/S-氨氯地平Cmax分别为（2.721.16）和（3.821.38）ng/mlTmax分别为（8.701.64）和（9.702.21）小时AUC0-t分别为（10748.8）和（16959.7）ngh/mlt1/2分别为（39.97.23）和（52.813.6）小时,受试者口服10mg氨氯地平片后人血浆中氨氯地平对映体的LC-MS/MS测定血药浓度-时间曲线,二、替诺福韦双特戊酯的体内药动学及其对左卡尼汀血药浓度的影响,替诺福韦（tenofovir）开环核苷磷酸类化合物新型核苷酸类逆转录酶抑制剂，具有抗HIV-1和乙肝病毒活性，但其生物利用度较低富马酸替诺福韦二吡呋酯替诺福韦的前药，生物利用度相对较高，已于2001年在美国批准上市,富马酸替诺福韦双特戊酯（tenofovirdipivoxilfumarate）结构修饰物，具有我国自主知识产权该药已获CFDA颁发的药物临床试验批件。期临床试验中，评价人体对于该药的耐受程度和药代动力学，为制订给药方案提供依据,试验设计与给药方法受试者禁食12小时后，早晨空腹给药，用250ml温开水吞服富马酸替诺福韦双特戊酯片150、300和600mg受试者口服药物前和服药后10、20、30、45分钟，1、1.5、2、3、5、8、12、24、36、48、72小时后各抽取血样5ml，然后立即离心获得血浆样品（试验样品），并将血浆样品于-20保存,色谱与质谱条件色谱柱采用InertsilODS-3（150mm4.6mm，5m），甲醇（A）-0.2%冰醋酸溶液（B）为流动相，梯度洗脱，0分钟（5%A）-0.8分钟（5%A）-1分钟（95%A）-4分钟（95%A）-4.1分钟（5%A）-5.5分钟（5%A）；流速1.0ml/min。ESI正离子模式，MRM检测；毛细管电压3.5kV；温度350；脱溶剂气600L/Hr；裂解电压，替诺福韦（130V），恩替卡韦（120V）；碰撞能量，替诺福韦（23eV），恩替卡韦（17eV）；样品检测：替诺福韦母离子m/z288.1，子离子m/z176.0；内标检测：恩替卡韦母离子m/z278.1，子离子m/z152.0,血浆样品处理,血浆0.4ml，加入40l甲醇-水（8020）溶液，加入内标溶液40l（恩替卡韦4000ng/m