放射免疫技术

第十九章放射免疫测定，放射免疫测定的基本概念和类型，放射性标记物的鉴定和纯化。放射免疫分析和IRMA测定原理和关键技术。放射免疫分析和IRMA的临床应用和评价，本章的要点，目录。放射免疫分析是一种体外测定超痕量物质的新技术，它结合了放射性核素的高灵敏示踪特性和抗原抗体反应的高度特异性。基本模式是用放射性核素标记抗原或抗体，通过免疫反应进行定量测定。它具有灵敏度高、特异性强、重复性好、样品和试剂用量少、操作简单、易于标准化等优点，已广泛应用于医学检验中。根据其方法学原理，放射免疫分析技术有两种主要类型：放射免疫分析法和IRMA法。第一节放射性核素和放射性标记物的制备，放射性核素作为放射免疫测定的标记物，选择哪些放射性核素以及如何制备放射性标记物(将放射性核素与抗原或抗体联系起来)是建立放射免疫测定的基础。放射性核素的基本知识基本概念是指在自然条件下发生的自发转换，从一种放射性核素到另一种，同时释放辐射(，)，也称为放射性衰变。根据衰变方式，基本类型有衰变、衰变和衰变。最常用的放射性核素是125碘、125碘，它们具有化学性质相对活跃、标记方法简单和容易获得高比活度标记的优点。伽马射线在衰变过程中产生，测量方便，效率高。半衰期适中(约60天)，废物更容易处理。125I的缺点，用125I代替H，可能使原物质的免疫活性受到影响；由于辐射损伤，标记抗原很容易变性。商品试剂的保质期相对较短。放射性核素放射性活动的检测使用辐射照射闪烁体(NaI晶体)，引起晶体分子激发，并且当去激发时，闪烁体发射特定波长的荧光；光电倍增管将极其微弱的荧光转化为光电子，并将其放大107倍。光电倍增管输出的电信号由放大器放大，由单通道分析仪筛选，并显示在定标器上。本发明涉及一种用放射性核素标记抗原和抗体的方法，主要包括间接标记法、直接标记法(氯胺T法)。125碘-，125碘或125碘，125碘标记物质(混合物)，Ch-T，LPO氧化和取代反应，(1)直接标记法氯胺T法(Ch-T)，其中氯胺T将125碘氧化为碘，I取代蛋白质酪氨酸苯环上的氢形成稳定的放射性标记物质(二碘酪氨酸)，最后加入焦亚硫酸钠(还原剂)终止反应。使用不含还原剂的高比放射性碘源比使用标记物的量少，而且碘的量少。总反应体积控制在200 L。在弱碱性反应条件下，反应时间为1分钟至2分钟。(2)间接标记法：预先用丁二酰胺酯通过Ch-T法标记125I，制备的125I脂肪官能团能与蛋白质分子上的氨基酸残基反应，使待标记物被碘化。放射性标记物质的纯化和鉴定(1)放射性标记物质的纯化由于游离125I和125I标记的抗原(抗体)分子的大小相当不同，凝胶色谱法可用于分离和纯化、聚合、损伤、标记的蛋白质、游离125I和具有比放射性更高的比放射性和比放射性更高的纯度的完全免疫活性。放射化学纯度单位标签中与标记物质结合的放射性百分比应大于总放射性的95%。免疫活性标记和抗体之间的反应性百分比越大，标记的免疫活性越好。(2)放射性标记的识别，自替代法计算，放射性比活度单位：化学量标记物中所含标记物的放射性比活度：Ci/gmCi/mgCi/mmol过高，会影响标记物的免疫活性，放射性比活度计算方法，结果不准确，计算不准确，制作常规放射免疫分析标准曲线。反应体系包括定量标记抗原、不同浓度的非标记标准抗原和限制性抗体。同时，在不添加非标记标准物质的情况下，仅添加抗体和不同剂量的标记抗原，制作了另一个自替代曲线。自取代曲线，标准曲线，反应平衡后，测定B/T%。如果从两条曲线中获得相同的B/T%，则(标记标准)标准曲线=(标记)自替换曲线。因此，可以直接计算标记抗原的含量，并且可以进一步获得比放射性。用自替代法测定的标记化合物的放射性比活度仅适用于放射免疫分析法标记的抗原。使用时应注意：标记和未标记物质对抗体(受体)的亲和力应相同；(2)非特异性结合应较小，并在计算中扣除；(3)制备标准曲线和自替换曲线时，操作步骤应相同，尤其是B和F的分离条件应相同。第2节放射免疫测定放射免疫测定(RIA)是一种使用放射性核素标记抗原(Ag*)与未标记抗原(Ag)竞争结合特异性抗体(ab)来定量测定待测样品中抗原的技术。检测原理放射免疫分析属于竞争分析。其基本原理是银*和银(测试物质银)对特定抗体具有相同的结合力。当三者同时存在于同一反应系统中时，银*和银相互竞争结合特定的抗体。银*和银与Ab的结合能力相同，Ab极限，银*定量，银*和银的量大于Ab结合位点，二者通过竞争与Ab结合；随着银含量的增加，Ag*和Ab形成的Ag* Ab配合物的发射减少，两者变为函数关系。(标准银/样品银)，ii。方法和类型，非平衡法，即标准抗原(或待测样品)和特异性抗体，优先平衡非标记抗原和特异性抗体，然后加入标记抗原与抗体竞争。反应体系中同时加入两种平衡法，即标记抗原、标准抗原(或待测样品)和特异性抗体。关键技术，抗原抗体反应，结合标记物的分离(分离技术)，放射测定，数据处理，反应条件，体积温度，时间，酸碱度，抗体，(标准银/样品银)，(1)抗原抗体反应，固体抗原抗体复合物。二级抗体沉淀、聚乙二醇沉淀、PR试剂法、活性炭吸附法、完全分离，试剂和过程的快速分离不影响反应平衡效果，也不受反应介质的影响。操作简单，重复性好，经济性好。(2)结合标签的分离，晶体闪烁计数器包括NaI闪烁晶体、光电倍增管，计数器测量的放射性信号是仪器输出的电脉冲数：每分钟计数(cpm)、参数cpmB/T(%)F/T(%)B/F(%)B/B0(%)。注：T为B和F之和，(3)数据处理，标准曲线，RIA因其灵敏度高、特异性强、精密度高、重复性好、耗血量少、能测量小分子量和大分子量物质等优点，在医学检验中得到广泛应用。它常用于测定各种激素和药物等。但是，放射性核素的放射性会对人体造成一定的危害，其废物的贮存和破坏会污染环境，因此必须注意操作。评价和应用第三节免疫放射分析IRMA是从放射免疫分析发展而来的核素标记免疫分析。其特征在于核素标记抗体直接与待测抗原反应，固相免疫吸附剂作为b或f的分离手段。首先，检测原理IRMA属于非竞争性免疫结合反应。其基本检测原理是在抗体上标记放射性核素(125碘)，用过量标记的抗体与待测抗原进行非竞争性结合反应，用固相免疫吸附法分离B和F.检测免疫复合物的放射性以获得待检测样品的浓度。方法和类型，(1)单位点IRMA，(2)双位点IRMA，(3)关键技术，抗原抗体反应，分离技术，放射性测定，数据处理，Ab*，Ag，Ab，(待测银)，(1)抗原抗体反应，固体抗原抗体复合物，*，固体抗原抗体复合物，固相吸附分离技术，(2)分离技术，一般采用物理吸附法：用碳酸盐缓冲液将预包被抗体稀释至3g/ml10g/ml，包被缓冲液(含游离物质和过量物质然后，加入1%的牛血清白蛋白溶液，密封并储存以备后用。晶体闪烁计数器包括NaI闪烁晶体、光电倍增管，由计数器测得的放射性信号是仪器输出的电脉冲数：每分钟计数(cpm)，参数cpmB/T(%)F/T(%)B/F(%)B/B0(%)，注：t是b和f之和，(3)数据处理，IRMA具有效率高、操作简单、灵敏度高、形状特殊、稳定性强等优点。四、评价和应用方面，IRMA缺点抗体用量较多，抗体纯化较困难，RMA测定对象主要限于具有两个以上抗原决定簇的肽或蛋白质。抗体适用于检测和分析大分子蛋白质和多肽激素，如肿瘤标志物CA15-3、人血清催乳素、胃蛋白酶、血清促甲状腺激素、凝血因子、降钙素、乙型肝炎表面抗原等。一些难以标记的病毒抗原也能被IRMA检测到。放射免疫分析是利用放射性核素标记抗原或抗体，通过免疫反应进行定量测定的