GBT 27980-2011 马病毒性动脉炎诊断技术

1220日41 雷雪中华人民共和国国家标准 279801马病毒性动脉炎诊断技术201 1言 本标准按照112009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(口。本标准起草单位：农业部热带亚热带动物病毒学重点开放实验室。 本标准主要起草人：张念祖、杨仕标、宋建领、杜健、王金萍、朱建波、李华春。27980279802011 本标准规定了马病毒性动脉炎诊断技术。本标准适用于马病毒性动脉炎的诊断和检疫。其中病毒分离、琼脂糖凝胶免疫扩散试验、反转录聚合酶链式反应试验适用于马病毒性动脉炎的病原诊断，中和试验和酶联免疫吸附试验适用于马病毒性动脉炎的抗体检测。2临床诊断21流行病学 马病毒性动脉炎是由马动脉炎病毒所引起的一种马的散发性呼吸系统和繁殖系统的接触性传染病，该病只感染马属动物，主要是通过生殖系统和呼吸系统而感染传播。公马带毒后无明显临床症状，却是危险的传染源。长期带毒的种公马可通过自然交配或人工授精的方式把病毒传给母马。流产马的胎盘、胎液、胎儿亦可传播本病。患病马在急性期通过呼吸道分泌物将病毒传给同群马或与其相接触的马。通过用具、饲料和饲养人员的接触也能将病毒传给易感马。该病呈世界性分布，血清学试验证实，我国也存在该病。22临床症状患马可表现为临诊症状和亚临诊症状，大多数自然感染的马表现为亚临诊症状。试验感染潜伏期为d，野外感染普遍为3d4d。本病的典型症状是发热，一般感染后3d14l，并可持续5d9d。表现厌食、精神沉郁、四肢严重水肿，步伐僵直，眼、鼻分泌物增加，后期为脓性粘液，发生鼻炎和结膜炎。面部、颈部、臀部形成皮肤疹块。公马的阴囊和包皮水肿，马驹和虚弱的马可引起死亡。怀孕母马流产，其流产率可达90以上。流产发生在感染后的10d30d，通常出现在临诊发病期或恢复早期。胎儿常在流产前就死亡，流产胎儿水肿，呼吸道粘膜和脾被膜上有出血点。母马痊愈后很少带毒，而大多数公马恢复后则成为病毒的长期携带者。这些症状并不是在同一马群中同时出现。马驹、老龄雌马和营养状况差的马，临床症状较重，孕马比空怀母马明显。除极少数患马发生死亡外，一般为轻度3病理变化死亡病例最主要的剖检变化是全身较小动脉管内肌层细胞的坏死，内膜上皮的病变导致特征性的出血和水肿以及血栓形成和梗死。常见大叶性肺炎和胸膜渗出物，发生全身性动脉炎的结果，所有浆膜和粘膜以及肺和中膈等都有点状出血。肾上腺上也有出血，在心、脾、肺、肾、怀孕母马的子宫、眼结膜、眼睑、膝关节或跗关节以下的皮下组织以及阴囊和睾丸内，均能发现出血及水肿变化。恢复期病马的慢性损害包括广泛性全身性动脉炎和严重的肾小球性肾炎。实验感染后观察到的损伤可分成3个型，即发展(渐进)型、终末(端)型及慢性活动型。从感染后4d6进)型损伤，发现胸腹水过多，淋巴结充血肿大，结肠到盲肠脉管水肿，大肠粘膜下淋巴结肿大，还可见粘膜上皮温和坏死。终末(端)型损伤被认为是发展(渐进)型损伤的延伸，表现为皮下水肿，胸腔大量积液，全身所有淋巴结肿胀到不同程度的出血，盲肠和结肠有梗死。粘膜下严重水肿和出血，有时可见肾上腺皮质出血。病毒接种127980第12天，可见慢性损伤，包括温和性淋巴结肿胀及胸腔内积液过多。实验感染后观察到的损伤的严重性很少与自然感染的损伤一样。24诊断依据上述流行病学特点、临床症状和病理剖检变化特征等可作出初步诊断，确诊后应该通过实验室 病原学和血清学诊断。3病毒分离31器材和设备 单道微量加样器(0500000卜L、200000滴头。一80冰箱，二氧化碳培养箱。组织研磨器、超声波振荡器、低速离心机、倒置显微镜。32试剂与材料血(采自血管)；细胞：兔肾细胞(细胞培养液(见附录A)。33病毒分离331样品的采集急性病例采取脱纤全血或沉淀白细胞层，鼻分泌物、结膜拭子或流产胎儿的体液及脾脏，被检种马的精液；尸体剖检时采取肺、脾和淋巴结，将病料置于含1000IU1磷酸盐缓冲液(。这些病料应立即用冰冷却，若不立即接种，应将病料迅速冻存于一80冰箱。精液的采集：使用一次射精时精子数量最多的部分精液。332样品的处理组织样品用含1000Iu0的比例，置于研磨器中剪碎并研磨。将已研磨好的待检病料，41000r上清液；分泌物和排泄物样品的处理，将棉拭子充分捻动、拧干后弃去拭子，41000r上清液；精液冻融3次或超声波裂解处理(100用细胞培养液作1：10的稀释，41000r上清液。将处理好的样品上清液用022用。333接种细胞将样品悬液接种于份样品接种5瓶，每瓶(生长面积2517吸附1h，再加5接种细胞置于37、5二氧化碳条件下培养12 d，每2d334观察与传代 接种后用倒置显微镜逐日观察细胞是否出现细胞病变(出现者收获，无无细胞病变者弃之。335病毒增殖、分装与保存为原始毒置于一80冰箱或液氮罐227980保存。将原始毒接种7、5二氧化碳条件下培养并逐日观察细胞病变，70以上细胞出 现病变时收集细胞病毒液，按1箱保存备用。病毒鉴定按本标准琼脂糖凝胶免疫扩散试验(反转录聚合酶链式反应(法进行。4琼脂糖凝胶免疫扩散试验(41材料和器械411器械：直径6径4样器。412阳性血清、标准马病毒性动脉炎高免血清。413阴性血清：无马病毒性动脉炎抗体和细胞毒性的健马血清。414标准抗原：纯化浓缩的马病毒性动脉炎病毒。415待检抗原：抗原应无污染，取少量样品加最少量的无菌生理盐水磨碎后作为待检抗原；病毒分离物浓缩(用聚乙二醇8000做100倍浓缩)后亦可作为待检抗原。42试验方法421琼脂平皿的制作(所用试剂均为常规分析纯试剂)：见附录B。422打孔：用直径4距为3孔后用针挑出切下的孔内琼脂块。423加样：用微量加样器或毛细吸管，吸取抗原或血清加于孔内，中央孔滴加标准阳性血清，周围的第1孔、第3孔、第5孔滴加对照阳性抗原，第4孔滴加阴性抗原，第2孔、第6孔滴加样品(待检抗原)，加样量以加满不溢出为度。加样后静置10人湿盒内37进行反应。243结果判定结果判定时将琼脂平皿置暗背景或侧强光照射下观察，若对照阳性抗原与标准阳性血清孔之间出现一条清晰、明显的白色沉淀线，而对照阴性抗原与标准阳性血清孔之间无沉淀线则认为试验可以成立，如果沉淀线没有或不明显则本试验不能成立，应该重做。结果判定标准如下：a)阳性：待检抗原孔与阳性血清孔之间出现明显清晰白色沉淀线，并与标准阳性孔的沉淀线相融合。b)阴性：待检抗原孔与阳性血清孔之间无沉淀线，标准阳性孔抗原的沉淀线直伸被检样品的孔边，判为阴性。44限制性说明本方法仅用于马病毒性动脉炎(原的普查，可能会出现非特异性反应。建议对反转录聚合酶链式反应(1仪器和设备合酶链式反应)扩增仪、台式低温离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、紫外灯、紫外凝胶成像仪、327980500000弘L、200000滴头，2试剂与材料 521材料：细胞病毒液或病料组织、外周血液或鼻分泌物。522试剂：柱离心式小量病毒糖核酸聚合酶链式反应试剂盒(逆转录上样缓冲液(10甘油和005溴酚蓝)、溴化乙锭(存液(10pg琼脂糖，丙醇等均为常规分析纯试剂，电泳缓冲液(配制方法见附录c)。 523引物：在马病毒性动脉炎病毒466"3操作程序531样品的采集和处理样品的采集和处理参见331和332。532病毒33425 的010的游引物0*)1游引物0)1板时设定阳性和阴性对照。将加有样品和对照下列程序和条件进行扩增：503042后按照(9515S，4215S，6845 s)反应35个循环，最后再687应产物可直接电泳检测，亦可于4或存待检测。54电泳取样于2琼脂糖凝胶孔中，5V0紫外凝胶成像仪或紫外分析仪上观察结果。 55结果判定在对照成立的前提下，即阳性对照出现相应大小扩增带(184阴性对照无此带出现的情况下判定结果。样品若出现和阳性对照分子质量相同的特异性扩增带，即判定为阳性，否则为阴性。6酶联免疫吸附试验(1器械和设备96孔高吸附力酶标板(平底，简称96孔酶标板)，单道微量加样器(o50027980140 0000000滴头，多道微量加样器(500肛L滴头，8道微量连续加样器(50005000 滴头。稀释试剂用灭菌瓶。4、一20冰箱，普通恒温培养箱。酶标读板仪、微型振荡器及磁力搅拌器。62试剂与材料621包被液：01碳酸盐缓冲液()，4保存。622酶标记羊抗马二抗(抗马4保存。623苯二胺)储存液；005吐温一20磷酸盐缓冲液(优质脱脂奶粉；30过氧化氢；2硫酸(所用试剂均为常规分析纯试剂，配制方法见附录D)。63操作程序631将包被抗原(20冰箱保存)用碳酸盐缓冲液按合适浓度稀释，每孔100密闭湿盒中，4过夜。632甩干包被液，用002的净。 633重复洗3次。634封阻，5脱脂奶粉的002每孔507振荡温育6035被检血清：将每份被检血清用含1脱脂奶粉的0021：5稀释，每份样品加一排，每孔50别用阳性血清和健康马血清作阳性和阴性对照，最后一排作空白对照。63637振荡温育6037加酶标二抗：辣根过氧化物酶标二抗用000稀释，每孔加5038 37振荡温育6039用1倍千。6310加底物用时按每毫升使用液加8氧化氢混匀而用，每孔加50311避光反应152的硫酸终止反应。 6312在酶标读板仪上读取490D。)，当阳性(60)和阴性(。o10)对照成立的前提下，样品孔光吸收值为阴性对照孔两倍或两倍以上时判为阳性，否则判为阴性。64限制性说明 本方法仅用于马病毒性动脉炎(体的普查，可能会出现非特异性反应。建议对阳性样品进行病毒中和试验验证，以排除非特异性的阳性样品。7病毒中和试验(国际贸易指定试验)71器材和设备96孔组织培养板(平底，简称96孔板)，单道微量加样器(o5,0止、50止、4000儿、200000滴头，多道微量加样器(5卜L50弘L、5000卜L)及滴头。4、箱，二氧化碳培养箱。27980试剂与材料721722723724725 保存)。726保存)。727病毒。阳性血清：标准马病毒性动脉炎高免血清。 阴性血清：无马病毒性动脉炎抗体和细胞毒性的健马血清。细胞：兔肾细胞(使用浓度30105个胞生长液：0犊牛血清+青霉素、链霉素(终浓度为100细胞维持液：牛血清+青霉素、链霉素(终浓度为100待检血清：应无污染，4保存不超过30d，试验前56灭活303试验准备731病毒繁殖：应用静止培养法，在大瓶弃细胞培养液，接种马动脉炎病毒于单层细胞，置37、5养箱中孵育1h，加新鲜细胞维持液，重置37、5养箱中培养；逐日观察，待上时收毒，在4间反复冻融3次，无菌离心(2000r0上清分装于保存备用。732毒价滴定：用含10胎牛血清、10新鲜豚鼠补体和抗生素(1000IU稀释液将马动脉炎病毒作101至10_6稀释，然后接种96孔微量板，每个稀释度接种8孔，每 孔25孔再补加25 孔加入用浓度30105个0时设置8孔细胞对照，即用50037、5件下培养细胞观察7d，在细胞对照成立的前提下，记录结果，按细胞半数感染量方法计算病毒的每25。733待检血清、阳性血清和阴性血清经56301；2倍比稀释至1：32。734病毒工作液的配制：将待检病毒用细胞生长液稀释为每25000个作为病毒工作液。74中和试验程序741病毒和血清等体积混合后置37孵育1夜。742接种96孔微量板，每组接种8孔，每孔50即补加50用浓度30105个743置于37、5件下培养细胞观察7d。744对照步骤如下所示：a)病毒对照：取病毒工作液，用细胞生长液作10、10、10一、10。四个稀释度，每个稀释度8孔，每孔2550生长液25”pL。b)细胞对照：设8孔，每孔加50生长液50c)阴性对照：设8孔，每孔加入1：2或1：10稀释的阴性血清和病毒混合液50即补加50用浓度30105个置于37、5件下同样培养细胞观察7d。75结果判定751判定条件7511细胞对照组应不出现细胞病变(62798012病毒对照，应保证在1000个的病毒液10_1和10。稀释度的各个孔均出现0_3有1个3个孔出现0。8孔全无513阴性血清对照应全部出现52判定标准在以上对照成立的情况下，哪组阳性血清抗体滴度大于等于1：4，即判为阳性。8说明在以上的检测方法中，当检测结果不一致时，病毒中和试验为最终的判定方法。279802011A1范性附录) 细胞培养液的制备分溶解后经022胞培养生长液是在滤过除菌营养液的基础上，按10加入灭活犊牛血清和后用75液调整左右。细胞培养维持液是在滤过除菌营养液的基础上，按2加入灭活犊牛血清和1000Iu后用75液调整左右。A2胰酶消化液配制  285