肿瘤的分子生物学检验PPT课件

肿瘤的分子生物学检查，2015.11.30，2，肿瘤标志物的研究历史第1阶段(1963-1978 ) :癌胚抗原1963年Evanfp1965年GoldFreemanCEA第2阶段(1979-1989 ) :糖链抗原主要在1980年koprowskica 19-9 (1116-ns-19-9 ) 1981年BastCA125(OC125 )第3阶段(1990以后):基因标记肿瘤基因标记，3，1，原癌基因(oncogene，onc )及其表达产物的作用1，定义：原癌基因原癌基因包括病毒癌基因(v-onc )和细胞癌基因(c-onc )两种，它们在正常情况下以非活性形式存在，因此被称为原癌基因。 负责控制正常细胞的生命活动。 细胞增殖、生长因子信号转导、细胞周期演变、细胞生存、DNA转录等。 如果这种基因发生某种错误或功能丧失，原癌基因就容易转化为将正常细胞转化为肿瘤的基因或癌基因。4，2，特征： (1)v-onc是病毒基因组中的特殊核苷酸序列，可引起细胞转化；(2)c-onc是正常细胞基因组中存在的癌基因，正常状态下处于静止或低表达状态，不仅对细胞无害， 5细胞癌基因与病毒癌基因核酸序列有同源性，它们的DNA序列相对应，表达产物也基本相同，6， 细胞癌基因的作用：通过其表达产物蛋白表达，负责调节正常细胞的生命活动，细胞增殖、生长因子信号转导、细胞周期进展、细胞存活及DNA转录等。7、2、癌基因定义：原癌基因进化保守，有责任调控正常细胞的生命活动。 细胞增殖、生长因子信号转导、细胞周期演变、细胞生存、DNA转录等。 如果这种基因发生某种错误或功能丧失，原癌基因容易转化为将正常细胞转化为肿瘤的基因或癌基因，8、3、原癌基因的激活机制原癌基因具有正常的生理功能，激活时具有致癌能力，因此原癌基因如何被激活目前已证实放射线化学致癌剂病毒感染，9、(1)原癌基因点突变(pointmutation )致癌基因在编码顺序特定位置的核苷酸发生突变，使其表达蛋白中相应的氨基酸发生变化，获得转化细胞的活性， 2222222222222222222222 (二)原癌基因获得外源启动子激活肿瘤细胞中原癌基因的表达水平表明可以在原癌基因上游插入外源启动子或增强子激活原癌基因，从而增加其表达产物的病毒增强子如果增强子插入原癌基因附近或较远，被活化，癌基因的表达从正常表达上升到数十倍至百倍，则11、(3)原癌基因的甲基化程度降低，活化DNA分子中的甲基化对抑制基因转录有重要作用，12、 目前在结肠腺癌和小细胞肺癌细胞中发现的ras基因的DNA甲基化水平明显低于邻近正常细胞，表明某些原癌基因的甲基化程度降低并激活，13、(4)原癌基因副本数增加的基因扩增(amplification ) :某些癌基因被一些机制复制到原染色体上，超过正常细胞的癌基因量，导致基因产物的增加而使细胞失常，如人视网膜母细胞瘤： N-myc扩增10-200倍，相应的mRNA和蛋白产物也大幅增加， 22卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡6控制环境改变，相对从静止状态转变为活性状态，原癌基因的表达产物显着增加导致肿瘤发生，15、染色体转位为9q34的c-abl基因转移到第22对染色体， 转位形成bcr-abl融合基因，提高表达，蛋白质产物也由p45转化为p10，导致其酪氨酸酶活性大幅增加的慢性骨髓白血病的发生，16，4，抑癌基因的抑癌基因(suppressergene )又称抗癌基因(anti-onc ) 如果这些基因突变、缺失或失活，可能会引起细胞恶性转化并导致肿瘤发生，17、(1)抑癌基因及其表达产物的抑癌基因可能与细胞分裂和分化的调控过程有关，与生长因子、某些蛋白激酶类的活性有密切关系， 抑癌基因给予细胞信号与原始抑癌基因相反，18 (2)抑癌基因失活机制1，视网膜母细胞瘤(retino-blastoma，Rb)(1)特征：基因组成： 27个外显子，3-17外显子区域为基因重组和突变的热点代码： ppm 具有结合DNA的活性，可被多种激酶系统催化磷酸化，19、(2)作用：在一定程度上磷酸化后，可缺乏或完全消失p105的活性。 非磷酸化Rb可以防止细胞增殖，当DNA肿瘤病毒抗原与非磷酸化Rb结合时，Rb的活性受到抑制，细胞变为无限增殖状态，形成肿瘤，20、分析来自视网膜母细胞瘤的Rb基因序列，发现Rb基因完全或部分缺失。 在其他Rb肿瘤中，基因完整，但序列分析显示突变，其常发生在剪切点，由于该突变在组装RbmRNA时外显子脱落，产生异常的Rb蛋白，21、抑癌基因又称隐性癌基因，基因1基因2原癌基因MW 、22、(2)p53基因特征： 17p 13，11外显子，10内含子编码： 393氨基酸，p53，23，作用：产物与DNA磷酸化。 (1)抑制肿瘤细胞停滞，修复前s期不能复制DNA，促进凋亡，24、野生型p53蛋白质p53降低bcl-2，提高bax，促进凋亡。在失去p53等位基因的肿瘤细胞中导入野生型p53可使肿瘤细胞凋亡，25、正常细胞的生长增殖受两个基因控制。 促进细胞生长和增殖，阻止终末分化癌基因负调控信号的产生。 促进细胞成熟，终末分化，最后凋亡(apoptosis)，抑制癌基因，两个信号能够精确地控制正常细胞的生长、增殖和死亡，同时保持动态平衡，如果失去平衡，则控制的信号基因功能会过度， 未被控制的信号基因失活，导致细胞增殖控制的混乱使细胞恶化，26，原癌基因的活化1，ras基因的变异2.myc基因的变异抑制基因的失活1，Rb基因的失活2，p53基因的失活3， 其他： BRCA1和BRCA2:遗传性多发乳腺癌相关基因与卵巢癌的发生也密切相关，27，5，检测方法： 1，PCR/ASO探针法(PCR/ASO探针法)检测基因片段经PCR扩增电在长度为20碱基左右的探针中，仅1碱基的差异就会使Tm值降低5.07.5，因此通过严格控制杂交条件，可以使与PCR产物完全互补的探针杂交，即野生型序列的产物仅与野生型探针杂交根据杂交信号的有无，判断被检测放大片段是否有突变点。28，2，受限片段多态性(RFLP )分析聚合酶链反应受限片段多态性(PCRRFLP )分析技术是基于PCR技术发展起来的。 DNA碱基取代发生在某限制酶识别部位，使酶切部位增加或消失，利用该酶切性质的变化，PCR特异性扩增含碱基取代的DNA，用某限制酶切断，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，与正常进行比较，判断有无变异。 应用PCRRFLP可以检测某个病原基因的已知点突变，直接进行基因诊断，也可以通过基因标记的连锁分析进行间接基因诊断。29、3、PCR-SSCP、测序等单链DNA分子具有特定的次级空间构象，突变DNA的PCR产物因其分子本身的碱基组成而发生改性后，在非改性聚丙烯酰胺凝胶电泳中发生了与正常DNA空间构象不同的两条单链30，4，改性梯度凝胶电泳(DGGE )在引物设计时使扩增的靶基因片段的两端具有不同的Tm值，用含梯度浓度改性剂的聚丙烯酰胺凝胶分离一端高、另一端相对高的PCR产物，游泳到与改性剂浓度对应的位置，产物片段中Tm值低由于野生序列和突变序列PCR产物片段的Tm不同，它们在电泳过程中部分解锁前后不同，经过一定时间的电泳，可以发现这些产物片段位于凝胶中的位置也不同，从而区分野生序列片段和突变序列片段.31、5、山楂嵌段具有一定同