病毒的细胞培养

病毒细胞培养、赵健乔、一基本原理二细胞培养的基本概念三主要优点四培养实验用品的预处理五培养细胞的生长方式和类型六细胞培养实验步骤七病毒的细胞培养、一基本原理、机械解离和消化等方法从活体中提取组织和细胞，分散到单一细胞中，给予必要的生长条件。 模拟体内生长环境，使体外生长和增值持续。 成长为致密的单层细胞后，将病毒接种细胞，在适当的环境下培养，每天观察细胞病变(CPE )为75%的细胞出现CPE，收获细胞，重复3次冻融，保存在-70下。细胞培养的基本概念、传代：细胞在培养器中生长一定时间后，分新的培养器接种。 原代培养：从体内新鲜组织中提取的体外生长细胞，在继代之前称为原代培养。两个主要优点，研究的对象是活细胞； 顾客研究的条件是可以人为控制的。 研究样本可以达到相对均匀性； 研究内容易观察、检查和记录； 研究的范围比较广泛； 研究的费用相对经济。 三分类，原代细胞培养继代细胞培养，原代细胞培养，概念：从供体获得组织细胞后，体外首次培养。 优点：生物学特性未发生较大变化，细胞染色体仍为二倍体，可接近体内生长特性反映，药物检测、细胞分化和病毒学实验缺点：传代次数多的细胞衰退。继代细胞培养、概念：原代细胞经过一系列继代后发生变异，转化为可连续继代的细胞。 继代细胞可以直接从肿瘤组织中获得，也可以通过人工驯化获得。 常用传代细胞： PK-15、IBRS-2、Vero、Marc-145、CHO、MDCK、CRFK、Hela等4种培养实验用品的预处理，(1)玻璃容器(2)塑料容器(2)包装3 .消毒：在组织细胞培养技术中，必须保证组织细胞无微生物生长、4 .细胞培养用液及培养基(液) :(1)水：蒸馏水、双蒸馏水、高压除菌成为可能。 (2)平衡盐溶液(PBS):PH为7.2-7.4，不含钙镁离子，可进行高压除菌。 (3)消化液：胰蛋白酶：常用胰蛋白酶的浓度为0.25%，pH为7.2左右。 需要过滤除菌。 EDTA液：常用浓度为0.02%，制备时不溶解Ca2、Mg2平衡盐液，可在高压灭菌后使用。 (4)培养基(培养液)是维持体外细胞存活和生长的溶液，可分为天然培养基和合成培养基。 天然培养基：天然培养基有血清、血浆、组织提取液(鸡胚和牛胚浸液等)。 优点：营养成分丰富，育成效果好缺点：来源有限。 成分复杂，影响某些实验产物的提取和实验结果分析，易发生支原体污染，合成培养基、合成培养基根据细胞生存所需物质的种类和量，采用人工方法模拟合成。 目前已设计出TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等多种培养基。 合成培养基的主要成分为氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其他辅助物质。 优点：标准生产，成分和含量相对固定。 成本低的缺点：部分成分不足，无法完全满足体外细胞的生长需求。 人工合成培养基只能维持细胞的生存。 为了使细胞生长繁殖，需要补充一定量的天然培养基(血清等)。血清中含有多种蛋白质(白蛋白、球蛋白、铁蛋白等)多种金属离子荷尔蒙促粘物质，如纤维蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 各种生长因子转铁蛋白不明成分，一般含有5%的小牛血清的培养基可以维持多个细胞的细胞不灭性，但是为了支持细胞的生长，必须加入10%的血清。 支持血清细胞生长的生物学效应已经被证明，但血清中的复杂成分尚不完全清楚。 血清质量的好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、犊血情、兔血清、马血清等，其中胎牛血清质量最好。 优质血清标准：透明，淡黄色，无沉淀物，细菌，支原体，无病毒污染。 血清灭活(除去补体活性):56，30分钟， (5)丙酮酸钠，葡萄糖：属于碳水化合物的成分，是细胞生命的能源。 (6)抗生素：最终浓度为青霉素100U/ml、链霉素100U/ml (青霉素80万U/瓶，将其溶解于4ml三蒸馏水，每升培养液加入0.5ml链霉素100万U/瓶，将其溶解于5ml三蒸馏水，培养液每升(7)冻结保存液：二甲亚砜(8)细胞生长液：用于维持细胞生长增殖的液体。 处方：基础培养基80%-90%血清的10%双抗100u/ml(9)细胞维持液：维持细胞不慢生长或死亡的培养液。 处方：基础培养基95%血清2%-5%双抗100u/ml，5培养细胞的生长方式和类型，附着生长型细胞必须附着在基质上才能生长的细胞。 从形态上可以大致分为上皮细胞型和成纤维细胞型，也有很难确定稳定的形态的细胞。 悬浮生长型细胞可以在悬浮状态下生长而不附着于基质；按世代粘贴生长细胞的生长过程，游离期粘贴壁期潜伏期对数生长长期停止期(平台期)， 在，六细胞培养的实验顺序，第1代细胞的培养以鸡胚成纤维细胞为例进行(1)取胚(2)组织处理(3)取消(4)分注、培养、(1)取胚，选择9-11日龄SPF鸡胚，头向上用镊子从气室边缘打开蛋壳，撕开壳膜，用无菌镊子轻轻取出鸡胚，放入灭菌盘中。(2)组织处理，用PBS液清洗胚体23次，去除鸡胚的头、爪、内脏，其馀的胚体用PBS液清洗胚体23次，放入盘子，用剪刀打碎鸡胚。(3)消化，用PBS液充分清洗组织碎片23次，加入胰蛋白酶消化液35倍量，在37下消化10分钟，每23分钟轻轻摇动一次。 组织碎片成块，边缘毛状模糊时取出，轻吸上层消化液，加入适量的DMEM培养液，用吸管反复吹散细胞。(4)分注、培养，将细胞悬浊液转移到细胞培养瓶中，在细胞培养瓶中加入10mlDMEM，充分混合，使细胞以单一的形式存在，最后放入恒温槽进行培养。 2继代细胞的培养，(1)细胞复苏(2)细胞继代(3)细胞交换液(4)细胞生长状况的观察，(5)细胞冻存，(1)细胞复苏概述，与复苏细胞冻存的要求相反，必须采取迅速融解的手段。 这保证了细胞外晶体在短时间内融解。 慢慢溶化，水分渗透到细胞内，形成细胞内的再结晶，不会对细胞造成损伤。操作步骤准备好培养瓶、培养液、离心管等，放入洁净的桌子中。 从液氮和低温冰箱中保管的冷冻保管(安瓶)的小袋和冷冻保管中取出的冷冻保管(安瓶)，直接投入37的温水中，轻轻摇动使内容快速溶解。 从37水浴中取出冷冻保存管或安瓶，离心1000r1min，用酒精消毒后打开，用吸管吸取上清液，充分混合培养液1ml，用刻度离心制成细胞悬浊液后，用低速离心除去上清液，必要时再用培养液清洗。 用培养液适当稀释后，接种培养瓶，放入CO2培养箱静置培养，次日更换培养液。 继续培养。 复苏时如果细胞密度高，必须立即传代。 细胞复苏时细胞数可稀释10-20倍，接种密度以5105/ml为宜。.(2)细胞的传代、原理是培养瓶生长成致密的单层后基本饱和(细胞增值达到一定密度后)，细胞继续生长，同时为了扩大细胞数量必须进行传代(再培养)。 传代培养也是保存细胞物种的方法。 也是利用培养细胞进行各种实验的必要过程。 悬浮型细胞只要直接分为瓶子即可，但是附壁细胞需要消化后再分为瓶子。 操作程序是丢弃充满细胞的培养瓶原来的培养液。 用1-2ml营养液或PBS缓冲液清洗培养瓶，注入含EDTA的胰酶1ml，清洗5面，注入含EDTA的胰酶1ml，培养瓶中发现1个小的空白斑，如果发现灰白色浑浊，则将胰酶注入培养液，用移液管吹走贴有细胞的面，将细胞从培养瓶的壁上吹走.操作顺序(1)吸入或舍弃培养瓶内的旧培养液(2)加入PBS溶液清洗细胞瓶的五面(3)加入足够量的细胞生长液，在37、5%CO2培养箱中静置培养。(4)细胞生长状况的观察、原理：应每日或隔日观察细胞，及时掌握细胞形态、数量及培养液pH、有无污染等情况，采取适当处理。 肉眼观察显微镜观察，(5)细胞的冻存、传代细胞需要足够的冻存设备。 一是防止细胞因污染等原因导致细胞系灭绝。 二是防止细胞因遗传世代过多而引起细胞老化和细胞变异。细胞冻存方法、(1)选择对数生长较长的细胞，用常规传代方法将细胞计数成悬浊液，以800-1000r/min离心5min，弃去上清液。 (2)用细胞冻存液悬浮沉淀物，将细胞浓度调整为106-107个/ml，分为冻存管，标明细胞名称、传代及冻存日期。 (3)冷冻保存：将冷冻保管在4放置30min，移至-80的超低温冰箱中一夜，放入液氮罐中长期保存。 也可以使用程序降温剂慢慢降温，冷冻保存速度首先为每分钟1-2，温度达到-25时，将降温速度调整为每分钟5-10，降到-100时，可以放入液氮罐中长期保存。 七病毒细胞培养是禽流感感染鸡胚成纤维细胞的例子。 (1)病材处理(2)病毒分离、繁殖(3)细胞病变的观察(4)效价测定(5)中和实验、 (1)病材处理、禽流感感染的禽心、脑、肺、淋巴结用含有双电阻的PBS液研磨，4一夜，以3000r/min离心10min，上清用0.22m的抽滤过滤采集效价最高的尿囊液接种细胞。 将2单层致密生长的鸡胚成纤维细胞液倒掉，用PBS反复洗净3次，将死亡或脱落的细胞洗净处理过的禽流感病毒液注入细胞瓶，将病毒液充分铺在瓶