松花粉多糖实验室提取技术规程

ICS62.020.01B05DB37山东省地方标准DB37/T 2020松花粉多糖实验室提取技术规程Technical specification for laboratory extraction of pine pollen polysaccharides2020-发布2020-实施山东省市场监督管理局 发布DB 37/T 前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东农业大学、山东省动物疫病预防与控制中心。本标准主要起草人：朱瑞良、魏凯、黄河、胡莉萍、杨萍萍、楚遵锋、刘宴博、崔莉、汪洋、徐启杰、陈峰。5松花粉多糖实验室提取技术规程1 范围本标准规定了松花粉中松花粉多糖的实验室提取及测定方法。本标准适用于松花粉中松花粉多糖的提取和测定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3 试剂或材料除非另有规定，所用试剂均为分析纯。3.1 水：符合GB/T 6682的规定的三级水。3.2 乙醚。3.3 胃蛋白酶。3.4 Sevag试剂，配制方法见附录A。3.5 无水乙醇。3.6 磷酸盐缓冲溶液（PBS），配制方法见附录A。3.7 葡萄糖对照品，纯度99%。3.8 浓硫酸。3.9 苯酚。4 仪器设备4.1 260目筛网。4.2 恒温干燥箱。4.3 超微粉碎机。4.4 电子天平：精度0.001 g。4.5 索氏提取器。4.6 水浴锅。4.7 高速离心机：转速不小于16000 r/min。4.8 旋转蒸发仪。4.9 真空干燥器。4.10 移液器：10 L1000 L。4.11 振荡器。4.12 分光光度计：波长范围380 nm780 nm。4.13 pH计。5 松花粉的准备于每年四、五月份采集松树的花粉，过260目筛网筛除杂质，放入恒温干燥箱中于70 烘干，用超微粉碎机破壁。6 泰山松花粉多糖的提取6.1 除脂破壁松花粉用脱脂滤纸分装成20 g独立小包，置于索氏提取器中，用乙醚回流抽提脂肪4 h，将除脂后的松花粉收集到烧杯中。6.2 浸提将除脂的松花粉与去离子水按1:10比例置于1000 mL烧杯中混合均匀，并加入0.3%的胃蛋白酶。将烧杯置于恒温水浴锅中，于50 让松花粉与胃蛋白酶充分反应2 h，然后在85 浸提8 h使多糖充分溶出。浸提过程中随时添加去离子水补充蒸发的水分，每30 min搅拌1次。浸提完置于4 冰箱过夜沉淀。6.3 过滤将浸提液用四层纱布过滤去掉杂质，然后将上清用离心机在8000 rpm条件下离心10 min，得上清，分装到1000 mL量程的烧杯中。6.4 浓缩将得到的上清液用真空旋转蒸发器浓缩至1/4体积；6.5 除蛋白沙维积（Sevag）试剂（附录A）与浓缩液1:5混合后置于振荡器上在250 rpm300 rpm条件下震荡30 min，再在5000 rpm8000 rpm条件下震荡15 min，然后用高速离心机在10000 rpm条件下离心，弃掉下层溶液和中间蛋白层，保留上层多糖溶液。该步骤重复2次以上。6.6 沉淀多糖将除蛋白后的多糖溶液缓慢加入到四倍量无水乙醇中，置于-20 冰箱让多糖沉淀过夜，弃上清，保留多糖沉淀于烧杯中。6.7 干燥多糖经真空干燥器干燥后得精制松花粉多糖（待测多糖）。7 多糖含量测定7.1 标准曲线的制作取8支干净的带塞试管，按表1方法分别加入相应体积的葡萄糖对照品溶液（附录A），然后在冰水浴中加入0.5 mL的6%苯酚溶液（附录A），震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞，沸水中放置20 min，取出后用凉水冷却10 min，以0号作为空白调零，在最大吸收波长处（490 nm）测定吸光度。以葡萄糖浓度X为横坐标（g/mL），吸光度Y为纵坐标，绘制曲线，即为标准曲线。用Excel软件求得回归方程。表1 标准曲线的制作的试剂配制方法管号01234567葡萄糖（mL）0.00.10.20.30.40.50.60.7苯酚液（mL）0.50.50.50.50.50.50.50.5浓硫酸（mL）3.03.03.03.03.03.03.03.07.2 结果计算将提取得到的干燥精致松花粉多糖用水溶解，定容至100 mL，取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以葡萄糖溶液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，注意乘以换算系数，既得待测多糖含量。7.3 结果判定用苯酚-硫酸法测的多糖含量大于80%以上，视为合格品。AA附录A （规范性附录）溶液的配制A.1 Sevag试剂的配制氯仿正丁醇5+1。A.2 磷酸盐缓冲溶液（PBS）的配制称取NaCl 8.00 g，KCl 0.20 g，Na2HPO412H2O 3.36 g，KH2PO4 0.24 g混合，溶于1000 mL的水中，混匀，测pH值应在7.27.4之间，若偏离此范围，用0.1 mol/L的HCl或NaOH调整。A.3 葡萄糖对照品溶液配制称取葡萄糖100 mg，水定容至100 mL，配制成1 mg/mL的葡萄糖液，摇匀后吸取10 mL该溶液，用水稀释定容至100 mL，即得100