急性毒性试验

急性毒性试验(单剂量毒性试验)主要观察中毒症状及其程度、发生和消失时间、死亡率，并计算最大剂量、最小致死剂量、半致死剂量(LD50)等。由于中药的毒性往往较小，单次给药往往不能显示出明显的毒性作用。我国药品监督管理部门也将一天内多次给药观察受试药物毒性的实验称为急性毒性实验。急性毒性试验的目的是评估新药对人类的急性毒性。同时，可为长期毒性试验、生殖毒性试验、致突变性试验等试验设计提供剂量选择依据和相关毒性信息。它还可以预测受试药物的毒性速度和持续时间，并与半数有效剂量(ED50)进行比较，以判断新药的安全系数。因此，急性毒性试验对于了解新药的毒性是非常必要的。鉴于不同实验室中各种因素导致的急性毒性试验结果(症状和致死剂量)差异较大，以及通过大量食用动物获得的动物毒性信息相对较少，各国目前正在修订急性毒性试验的技术要求，希望通过尽可能少使用动物获得有价值的信息，同时达到急性毒性试验的目的。(1)动物(1)动物物种(或品系)的差异是动物急性毒性差异的主要原因，而药物酶是毒性物种差异的重要原因之一。为了预测新药对人类的急性毒性，一些发达国家要求包括非啮齿动物(除兔子外)在内的两种动物进行动物急性毒性试验，我国对此没有明确规定。由于中药在临床上已经使用了很长时间，一般认为急性毒性试验的目的基本上是通过使用动物来实现的，特别是在特殊情况下。目前，虽然常用的实验动物是小鼠或大鼠。但是，在某些特殊情况下，例如，如果已知受试物质含有强烈的胃肠刺激物，也应该用大型非啮齿动物进行测试。否则，即使毒性相对较高(如巴豆油)，也不会引起小鼠和大鼠的呕吐反应。动物的年龄、性别和体重的急性毒性受动物的健康状况、年龄、性别、遗传因素、体重、药物吸收、分布、代谢、排泄和内分泌激素的影响。幼年动物药物通常具有低的酶活性，并且对代谢后减毒的药物具有高毒性。此外，年轻动物的药物代谢功能和敏感性很容易改变，两性之间的特征尚未确定。因此，口服毒性通常使用性成熟的年轻动物，如6-8周龄的小鼠，雌雄各半，体重18-22g(同一试验中的体重差不超过2g)，6-8周龄的大鼠，雌雄各半，体重120150g(同一试验中的体重差不超过10g)。(3)动物的数量根据不同的测试而变化。最小致死剂量或半致死剂量，小动物(大鼠、小鼠)试验组分为三组以上，每组至少像10只动物(一半雄性，一半雌性)。一些国家没有规定动物和动物群体的数量，因此，只有3个动物群体经过多个群体的测试，以获得近似的致死剂量或LD50。大型动物(狗和猴子)并不总是需要LD50。少量动物可以通过增加剂量来观察中毒症状，并且可以获得近似的致死剂量。最大剂量测试-通常需要20只小鼠或大鼠。制剂实验应在符合GLP标准的实验室进行，实验样品的质量和稳定性应符合要求，并与药效学和临床试验相一致。(1)中药样品液浓缩液或提取物的制备。该中药制剂可以通过向提取物中加入水而不加入辅料，或者用0.5%羧纤维素钠、0.5%吐温-80、5%阿拉伯胶等助悬剂和增溶剂制成混悬液，尽可能多地制成水溶液。水不溶性成分可与植物油制成油溶性乳剂。乙醇和聚乙二醇等溶剂也可用于制备样品溶液(2)样品溶液的浓度和给药能力为了获得最低致死剂量或半致死剂量，有必要设置不同的剂量组，使某些组的反应率在50%以上，而某些组的反应率在50%以下。设定不同剂量有两种方法，一种是给药浓度必须不同，另一种是给药浓度必须不同，各有其优点。该浓度必须适用于某些固定浓度的制剂，具有避免渗透、粘度、溶质颗粒的分散状态等理化性质对毒性试验结果的影响的优点。因此，浓度也必须获得更好的结果。然而，由于动物的剂量有限且范围狭窄，根据体重的剂量容量难以满足试验要求。因此，通常采用相同体积和不同浓度的给药方法。注射药物溶液的浓度应相对于体液浓度等渗(至少不是低渗)。不应该特别考虑口服液。对于低毒性中药制剂，应采用能保持一定流动性的最大浓度作为口服样品溶液。给药方法(1)购买禁食动物后，应在实验室观察动物一周。口服前，为了减少大剂量给药引起的吸收差异和急性胃扩张，小鼠和大鼠应停止进食至少4-6小时，并应停止进食过夜(不停水)，并在给药后3-4小时停止进食。(2)给药途径除临床给药途径外，类和类新药也希望有其他给药途径。水溶性药物应同时静脉注射给药，而其他药物如油和混悬液可皮下注射给药。腹腔注射液很少用于人体，中药制剂成分复杂，在动物毒性试验中也尽量少用，以避免腹腔刺激的干扰。对于小鼠，每种给药途径的容量通常为0.4-0.5毫升/20克(体重)，对于大鼠，为LML/100克(体重)。小鼠最大口服量不超过0.8毫升/20克(体重)，其他途径不超过0.5毫升/20克(体重)。大鼠最大口服容量不超过2ml/100g(体重)，其他途径不超过lml/100g(体重)。(1)观察指数不能将获得的致死剂量视为急性毒性试验的唯一要求。发现毒性症状和毒性反应的靶器官也是急性毒性实验的一个非常重要的目的。服药前后应观察体重、进食量和饮水量，并密切观察异常中毒症状，尤其是服药后第1天和第2天。在接下来的1天内至少观察一次，观察症状7天，包括动作：不稳定、多动症和发声；神经系统反应：抬尾、摇晃、痉挛、运动障碍和姿势异常；自主神经系统反应：突眼、流涎、流涎、排尿、腹泻、直发、皮肤变色、呼吸；死亡。每天应记录体重、毒性反应和死亡。濒临死亡的动物应该分开饲养。死亡后，应及时取出进行肉眼观察和组织病理学观察。实验结束时，解剖存活的动物，如果有任何病理变化，则进行组织学观察。(2)致死剂量可采用布利斯点倾斜法、简化概率法和改进的考克斯序贯法计算最小致死剂量或半致死剂量。布利斯方法严谨而精确，但它的缺点是计算非常复杂。然而，计算机软件在现代是可用的。Bliss方法可推荐用于果汁计算。各种方法的原理基本相同，如：剂量刘值应等差，即剂量应等比数列排列；各组动物数量应相等；(3)死亡率应基本对称分布在50%左右等。然而，每种方法都有其特殊的设计要求。例如，有些要求Dm和Dn具有100%和0%的死亡率，请参考相关的专著，其中更具体地说，就是要找到0死亡的最大剂量和100死亡的最小剂量的估计值，以确定实验中使用的最大剂量(Dm)和最小剂量(Dn)。这在决心中非常重要，也是实验成败的关键。可以用雌性或雄性动物，成立四个以上的小组，每组3-4只，先用1只；10(例如5毫克/千克、50毫克/千克、500毫克/千克、5000毫克/千克的固定剂量)。观察第7天，记录死亡动物的数量。然后在4/4到0/4组死亡之间按1；2(例如50毫克/千克、100毫克/千克、200毫克/千克、400毫克/千克)来测量大约0%和100%的死亡率。正式试验：在初步试验中，在Dn和Dm的剂量范围内，按等比建立三个以上的剂量组，各组之间的剂量比一般为1；在0.6到10.9的范围内。购买的动物应在试验前驯养一周，并根据体重随机或分组。每组应有10只以上的动物，每只动物一半是雄性，一半是雌性，并分别编号。给药前，动物应禁食(无水)过夜。在每个给药组和溶剂对照组根据其体重给药后，应在试验日进行多次观察。从第二天到最后一天，每天应同时观察两人以上一次，并及时详细记录中毒反应症状、症状出现和消失的时间以及死亡时间。在第七天，所有的动物都应该通过测量它们的体重和尸检来杀死，并且应该用肉眼观察病理变化。有毒性反应、体重减轻或器官病变的动物应在尸检后立即进行主要器官的组织病理学观察。布利斯方法可用于计算LD50、最小致死剂量及其置信限。柯蒂斯法、点斜法、简化概率单位法或其他计算方法都可以改进。果汁计算结果的比较表明，不同果汁计算方法的结果一般没有明显差异，而同一样品在不同实验室的测试结果往往有显著差异。因此，通过使用更简单的计算方法，可以完全满足LD50计算的精度。最大剂量试验与受试药物的浓度或体积限值相同。如果不能测量LD50，应进行最大剂量试验。在实验中，选择推荐用于临床试验的给药途径，并给予动物可耐受的最大浓度(溶液仍具有良好的流动性)和一天内一次或2-3次的最大给药量。以小鼠口服为例：动物数量不少于20只，雌雄各半，每次剂量体积不超过0.4毫升/10克(体重)，多次剂量间隔不小于4小时，观察第7天记录毒性反应和体重变化。如果仍然没有毒性反应或正常体重增加，可以认为该药物在小鼠中的最大剂量没有毒性反应，或者LD50大于最大剂量。统计上，剂量不能大于LD14。如果在10只动物中没有发现毒性反应或死亡，剂量不能大于LD26。近似致死剂量试验近年来，国外已有确定少量动物近似致死剂量的方法。其中一些类似于LD50的预测试或霍恩的方法。每组使用3-4只动物，并建立多组。详细观察血液学、血液生物化学和组织病理学，并记录在动物毒性反应孔中。有些采用剂量递增法，即动物剂量按几何级数递增，下一个剂量根据前一个剂量的反应来确定。或者采用剂量累积法，将同一批动物按一定时间间隔、从小到大的剂量给药，观察毒性反应，同时结合血药浓度的测定，确定动物的急性毒性反应、靶器官、毒性或致死剂量以及毒性反应中的血药浓度。剂量增量法类似于LD50测定的阶梯法(或称为顺序法和上下法)。适用于小动物，毒性反应快。它可以由10-20只动物决定。剂量累积规则是适用的总结报告应包括摘要、试验物品、试验动物、试验环境、给药方法、观察方法、毒性反应症状、体重变化、组织病理学变化、男性反应和死亡的发生时间、LD50和LD5的计算方法及其置信限和结果讨论。根据试验结果，综合评价其急性毒性。(2)安全性评价(1)根据急性毒性试验结果判断受试药物的毒性强度和类型。中国没有统一的法规。(2)急性毒性试验结果对临床研究具有指导意义，可为临床研究中探索安全有效剂量以避免急性不良反应提供依据。然而，鉴于人体和各种动物对各种化合物的吸收、分布、代谢、排泄和毒性的差异，没有可遵循的规则。现有的化学统计表明，在临床研究中，从低到高的安全治疗剂量的探索仍需根据实验结果和文献报道进行。(3)急性毒性试验结果对估算长期毒性试验剂量以及不同动物物种之间的差异具有重要意义。急性毒性结果通常是不同的，没有规则，无论是按体重剂量还是体表面积剂量计算。如果用同一动物进行急性毒性试验和长期毒性试验，则急性毒性试验的剂量对长期毒性有较大的参考价值。即便如此，也应该考虑药物的累积效应。虽然也可以在不同种类的动物中进行剂量估算，但只能作为参考。在进行长期毒性试验之前，仍然需要进行必要的预试验。动物规格和数量的长期毒性试验一般由雌雄各半、健康、无疾病和检疫合格的动物组成。各组平均体重相似，体重变化小于20%。对照组中的动物数量可以与给药组中的相同，或者可以根据下式计算：对照组中的动物数量：给药组中的动物数量x给药组数量的平方根。对于试验期3个月内的啮齿动物，应使用6-8周龄的大鼠，每组大鼠的数量不应少于20只。非啮齿类动物可以使用6-10个月大的狗，每组6只。对于试验期超过3个月的啮齿动物，应使用5或6周大的大鼠，每组大鼠的数量应增加到30-40只。非啮齿类动物可以使用4-6个月大的狗，每组6只。确定各组动物数量的原则主要考虑药物毒性导致的实验动物死亡数量、实验中死亡的动物数量以及观察实验结束时和停药后的恢复情况时可用于统计分析的动物数量。(1)良好的通风：动物饲养室内的空气交换率和空气流速可控制在10-15次/小时和13-18厘米/秒，目的是便于动物散热，消除气味、灰尘和微生物，而不明显影响动物的室内温度、湿度和能耗。(2)光照规律：由于生物节律对动物的反应性有明显的影响，光照会影响动物的生物节律，从而影响不同批次之间的毒性比较。大鼠和小鼠应亮12小时，暗12小时。仓鼠应该14小时明亮，10小时黑暗。(3)环境清洁度：微生物或寄生虫感染等。会影响毒性试验的结果。如果条件允许，应尽可能选择清洁和SPF测试设施。(4)温和稳定的温度和湿度：常温动物的温度在15-33之间波动在1.5摄氏度以内。湿度是一种潜热，应控制在30%-70%之间。温度和湿度的突然变化以及体温的轻微变化并不意味着动物的生理状况不受影响，还会导致动物对外部环境变化的抵抗力下降，并影响毒性试验结果。(5)室内噪声最好在50dB以下：男女应分开存放，不应拥挤。必要时(如混合喂养或精确确定饮食)，应将其放在一个笼子里。然而，应该注意的是，动物的反应保持在本书中的长期毒性实验与目前国际上关于重复给药毒性实验的概念基本一致，包括过去的“亚急性毒性实验”、“亚慢性毒性实验”、“慢性毒性实验”和“终身毒性实验”等名称。长期毒性试验的主要目的是：观察在选定的时间内对动物重复给药时，目标组织或器官、剂量-效应关系和动物损伤的可逆性；第二是了解实验动物可以忍受的剂量范围和对人类无毒的安全剂量。构成长期毒性实验的三个主要部分是实验