19-21学时-实验五--细菌计数、大小测定、运动观察

黔南民族师范学院微生物学实验 课程教案NO:19-21学时 2014年4月14日 第7周 周1 57学时 第一实验楼微生物实验室授课题目实验五 微生物大小测定、显微镜直接计数和悬滴观察课时安排3学时教学目的要求1学习并掌握利用显微测微尺测量微生物大小的方法； 2学习并掌握利用血球计数板测定微生物细胞数的原理和方法；3学习并掌握微生物的悬滴观察方法4. 巩固显微镜使用技术。教学重点难点学习重点：细菌革兰氏染色的原理和方法。学习难点：革兰氏染色关键技术的掌握。教 学 内 容 及 时 间 安 排方法及手段1 显微测微尺测量微生物细胞大小；2 血球计数板测定微生物细胞数3 微生物的悬滴观察实践教学作业布置：按要求完成实验报告。备注：实验五 微生物大小测定、显微镜直接计数和悬滴观察1 目的要求1.1 学习并掌握微生物细胞大小测定的原理和方法；1.2 学习并掌握利用血球计数板测定微生物细胞数的原理和方法；1.3 学习并掌握悬滴法观察细菌的运动。2 原理2.2 显微测微尺测量微生物大小的原理因为微生物的个体通常只在显微镜下可见，所以其大小测量也应在显微镜下进行。用来测量微生物大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。镜台测微尺专用于校正目镜测微尺每格的长度，是中央部分刻有精确等分线的载玻片。全长1mm，等分为100小格，每一小格长为10m，见图5-3。目镜测微尺的刻度刻在一个略小于目镜内径的圆玻璃片上，有等分50小格和100小格两种，每5小格间有一长线相隔。当将此测微尺放在目镜内观察物象时，可同时看见物象和测微尺，但是在配合不同放大倍数的物镜时，目镜测微尺每刻度间的长度会发生变化。所以，目镜测微尺不能直接用来测量微生物的大小，使用前必须利用镜台测微尺进行校正。 图5-1 用镜台测微尺校正目镜测微尺2.2 血球计数板测定微生物细胞数的原理计算单位体积内微生物细胞数目的方法很多，有平皿培养法、光密度法、血球计数法等，其中后者具有直观、简便和快速等优点。其原理是：将经过适当稀释的菌体细胞或孢子悬液，加到血球计数板的计数室内，在显微镜下逐格计数。因为计数室的容积是固定的（0.1mm3），所以可将在显微镜下计得的细胞数（菌数或孢子数）换算成单位体积试样中的菌数。由此法得到的是死菌和活菌的总数。血球计数板是一块特制的载玻片，中部有H形的沟槽将中部分成上下两个计数室。如图5-2所示。计数室方格的边长为3mm，每个方格分为9个大方格，正中央的大方格被分为25个中方格，每个中方格又被分为16个小方格（有的大方格被分为16个中方格，每个中方格又被分为25个小方格），无论哪种规格的计数板正中央的大方格都分成400个小方格（图5-3）。1个大方格的边长为1mm，则每个大方格的面积为1mm2,盖上盖玻片计数室的高度为0.1mm，即计数室的容积为0.1mm3（10-4mL）。计数时，一般数5个中方格的总菌数，计算每个中方格的平均数，再乘以25或16（25或16个中方格），得到一个大方格中的总菌数，然后再换算成1mL菌液中的总菌数。计算公式如下（25个中方格为例）：1mL菌液中的总菌数（个）= 5个中方格中的总菌数/525104稀释倍数 图5-2 血球计数板的构造 a.平面图（中间平台分为两半，各有一个计数室） 图5-3 血球计数板中央大方格的刻度b.侧面图（中间平台与盖玻片之间有高度为0.1mm的间隙） （25中格16小格）2.3 悬滴法观察细菌的运动用凹玻片的凹槽对准盖玻片中央的菌悬液，并轻轻盖在盖玻片上，使两者粘在一起，然后反转凹玻片，使菌液恰好悬在凹槽中央，细菌可在其中自由运动。3 材料与器具3.1 菌种 （1）金色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（2）枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）（3）酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）（4）苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）（5）十字花科软腐病菌（Erwinia aroideae）（6）大肠杆菌（Escherichia coli）（7）坚黑粉菌（Ustilago hordei）3.2 其它血球计数板，显微目镜测微尺,显微镜台测微尺，凹玻片，凡士林，盖玻片，无菌滴管，吸水纸，擦镜纸，振荡器。4 内容及方法步骤4.1 显微测微尺测量微生物大小（1）校正目镜测微尺：安装目镜测微尺：取出目镜，旋开透镜螺旋，将目镜测微尺刻度朝下放入目镜筒，然后旋好螺旋，插入显微镜筒（图5-4）；置镜台测微尺：将镜台测微尺放在载物台上，使刻度面朝上；校正：在显微镜下观察，调准焦距，当看清镜台测微尺后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度相平行，然后移动推动器，使目镜测微尺和镜台测微尺的某一区间的两条刻度线完全重合，再数出两条重合线间各自所占的格数，根据公式得到校正后的目镜测微尺每小格的长度。见图5-1。分别在低倍镜、高倍镜和油镜下校正目镜测微尺。目镜测微尺每小格长度（m）= 两条重合线间镜台测微尺的格数10两条重合线间目镜测微尺的格数图5-4 安装目镜测微尺将目镜测微尺的校正结果填入表5-1。表5-1 显微镜目镜测微尺刻度的校正结果 目镜放大倍数：物镜物镜倍数目镜测微尺格数镜台测微尺格数目镜测微尺每格代表的长度（m）低倍镜高倍镜油 镜（2）酿酒酵母细胞大小测定制备菌悬液：向酿酒酵母菌斜面内加入10mL 无菌水，用无菌接种环刮下菌苔后，充分振荡，然后适当稀释至103，待用；制酿酒酵母水压片：取一洁净载玻片，在中央滴1 滴菌悬液，小心盖上盖玻片，用吸水纸将多余的液体吸干，千万不要产生气泡；测量酿酒酵母菌体大小：将酿酒酵母水压片放在载物台上，在显微镜下看清菌体后，转动目镜测量酵母细胞菌体的直径。分别在低倍镜、高倍镜和油镜进行测量，每次测量10个细胞；整理：取下目镜测微尺，擦净后收好。结果报告将高倍镜下测量的结果填入下表5-2。表5-2 酿酒酵母或坚黑粉菌细胞大小的测量结果菌细胞编号12345678910平均值目镜测微尺格数细胞直径m（3）细菌细胞大小测定制备细菌涂片 取一干净的载玻片，滴一滴无菌水在其中央，无菌操作下，用接种环挑取适量细菌菌落于无菌水中，充分混匀得菌悬液，过火焰固定。简单染色 G+菌用结晶紫染色，G-用番红染色，干燥后油镜观察。整理 取下目镜测微尺，擦净后收好，显微镜用二甲苯清洗。表5-3 金色葡萄球菌细胞大小的测量结果菌细胞编号12345678910平均值目镜测微尺格数细胞直径m表5-4 枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌或大肠杆菌细胞大小的测量结果菌细胞编号12345678910平均值目镜测微尺格数细胞宽度m细胞长度m结果报告 观察结果分别填入表3、表4，并将下列问题融入讨论中在一台显微镜上标定的目镜测微尺长度，当换用另一台显微镜时其长度是否有效？为什么在测量微生物细胞大小时要多取几个样本测量？试分析活细胞与经染色的细胞大小有无区别？4.2 血球计数板测定微生物细胞数4.2.1酿酒酵母细胞数测定（1）制备菌悬液 向酿酒酵母菌斜面或干酵母粉，加入10mL无菌水，充分振荡，然后适当稀释至10-3，待用。（2）加菌液 先用擦镜纸将血球计数室擦净，用无菌滴管取少许酿酒酵母菌稀释液滴入上下两个计数室内，盖上专用的盖玻片，绝对不能有气泡，否则重做。（3）计数 先在显微镜下找到计数室，在正中央的大方格中沿对角线取9个中方格，计数每个中方格的菌数。（4）结果报告 将计得酵母菌细胞数填入表5-5，并计算单位体积的菌数（个/mL）。4.2.2黑粉菌细胞数测定（1）制备菌悬液 取一穗麦黑粉菌标本，加入10mL无菌水，充分振荡，然后适当稀释至10-3，待用。表5-5 微生物细胞的血球板计数结果统计计数微生物计数室各中格细胞数5个中格总细胞数A菌液稀释浓度B两室平均数细胞数个/mL12345酿酒酵母菌分生孢子第一室细胞数第二室细胞数黑粉菌第一室细胞数第二室细胞数（5）小结与讨论要求将下列问题体现于讨论中。哪些操作步骤会影响血球计数板计数的正确性？试比较血球计数和平皿计数所得结果的不同，并分析原因。4.3 悬滴法观察细菌的运动（1）制备菌悬液 用无菌长滴管分别向枯草芽孢杆菌、大肠杆菌斜面滴加5mL 无菌水，制成轻度混浊的菌悬液；（2）涂凡士林 取一干净无油的盖玻片，在其四周涂少许凡士林；（3）滴菌悬液 用无菌长滴管分别向盖玻片中央滴1滴菌悬液；（4）盖凹玻片 将凹玻片的凹槽对准盖玻片中央的菌悬液，并轻轻盖在盖玻片上，使两者粘在一起，然后反转凹玻片，使菌液恰好悬在凹槽中央； 凹玻片 悬滴标本正面 悬滴标本侧面图5-5 悬滴观察玻片（5）镜检：由于菌体透明，镜检时可适当缩小光圈或降低聚光器，以增大反差，便于观察；可先在低倍镜下找好视野，再转换至油镜下仔细观察，注意区分细菌运动与布朗运动的区别。前者在视