霉菌、酵母菌及空气检测

食品中霉菌、酵母菌数的测定,由于遭到霉菌和酵母菌的侵染，食品和粮食常常发生霉坏变质，有些霉菌的有毒代谢产物引起各种急性和慢性中毒，特别是有些霉菌毒素具有强烈的致癌性。实验证明，一次大量食入或长期少量食入，皆能诱发癌症。目前已知的产毒霉菌如青霉、曲霉和镰刀菌。,方法一、霉菌和酵母计数法,霉菌数的测定是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1mL检样中所得的霉菌落数。,除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：,一、设备和材料,冰箱：25,恒温培养箱：281,均质器,恒温振荡器,显微镜：10100,电子天平：感量0.1g,无菌锥形瓶:容量500mL、250mL,无菌广口瓶：500mL,无菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度),无菌平皿：直径90mm,无菌试管:10mm75mm,无菌牛皮纸袋、塑料袋,加入葡萄糖和琼脂，加热溶化，分装后，121灭菌20min。倾注平板前，用少量乙醇溶解氯霉素加入培养基中。,1、马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基,二、培养基,马铃薯(去皮切块)300g,葡萄糖20.0g,琼脂20.0g,氯霉素0.1g,蒸馏水1000mL,制法：,将马铃薯去皮切块，加1000mL蒸馏水，煮沸10min20min。用纱布过滤，补加蒸馏水至1000mL。,上述各成分加入蒸馏水中，加热溶化，补足蒸馏水至1000mL，分装后，121灭菌20min。倾注平板前，用少量乙醇溶解氯霉素加入培养基中。,2、孟加拉红培养基,蛋白胨5.0g,葡萄糖10.0g,磷酸二氢钾1.0g,硫酸镁（无水）0.5g,琼脂20.0g,孟加拉红0.033g,氯霉素0.1g,蒸馏水1000mL,制法：,三、检验程序,检样,处理,稀释,平板分离培养,菌落计数,报告,四、操作步骤,1、样品的采集,用灭菌工具采集可疑霉变食品250g，装入灭菌容器内送检。,谷物加工制品（包括熟饭、糕点、面包等）、发酵食品、乳及乳制品以及其他液体食品，用灭菌工具采集可疑霉变食品250g，装入灭菌容器内送检。,粮食（包括粮库贮粮，粮店或家庭小量存粮）样品的采集，可根据粮囤或粮垛的大小和类型，分层定点取样，一般可分三层五点，或分层随机采取不同点的样品，充分混合后，取500g左右送检。小量存粮可使用金属小勺采取上、中、下各部位的混合样品。,样品的稀释,在制备10倍系列稀释样品匀液时，用吸管反复吹吸5次,用吸管反复吹吸50次，使霉菌孢子充分散开。,根据对样品污染状况的估计，选择2个3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），每个稀释度分别吸取1mL样品匀液于2个无菌平皿内。,2、接种,同时分别取1mL样品稀释液加入2个无菌平皿作空白对照。,及时将冷却至46的马铃薯-葡萄糖-琼脂或孟加拉红培养基(可放置于461恒温水浴箱中保温)倾注平皿，每皿倒15mL20mL，并转动平皿使其混合均匀。,3、倒培养基,4、培养,待琼脂凝固后，将平板倒置，281培养5d，观察并记录。,5、菌落计数,肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落形成单位（CFU）表示。,霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。,选取菌落数在10CFU150CFU的平板。,根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。,菌落数应采用两个平板的平均数。,6、结果计数,（1）计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算。,（2）若所有平板上菌落数均大于150CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。,（3）若所有平板上菌落数均小于10CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。,（4）若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算；如为原液，则以小于1计数。,7、报告,（1）菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。,（2）菌落数大于或等于100时，前3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数来表示结果；也可用10的指数形式来表示，此时也按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字。,（3）称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告，报告或分别报告霉菌和/或酵母数。,方法二、霉菌直接镜检计数法,常用的为郝氏霉菌计测法，本方法适用于番茄酱罐头。,1、设备和材料,折光仪,显微镜,郝氏计测玻片：具有标准计测室的特制玻片,测微器：具标准刻度的玻片,盖玻片,霉菌可以作为一种指示菌，表明加工制品的原料有霉菌所致的腐烂存在。,2、操作步骤,检样的制备：,取定量检样，加蒸馏水稀释至折光指数为1.34471.3460（即浓度为7.9%8.8%），备用。,显微镜标准视野的校正：,将显微镜按放大率90125倍调节标准视野，使其直径为1.382mm。,涂片：,洗净郝氏计测玻片，将制好的标准液，用玻璃棒均匀的摊布于计测室，以备观察。,按100个视野计，其中发现有霉菌菌丝体存在的视野数，即为霉菌的视野百分数。,观测：,将制好之载玻片放于显微镜标准视野下进行霉菌观测，一般每一检样观察50个视野，同一检样应由两人进行观察。,结果与计算：,在标准视野下，发现有霉菌菌丝其长度超过标准视野（1.382mm)的1/6或三根菌丝总长度超过标准视野的1/6（即测微器的一格）时即为阳性（+），否则为阴性（-）,第一节空气洁净技术,1.空气微生物的卫生标准及检测方法,室内空气中细菌总数规定撞击法4000cfu/m3;沉降法45cfu/皿。（GB/T17093-1997）,高效过滤器、紫外线消毒，空气熏蒸法（过氧乙酸）,空气检测技术和净化技术,检验环境中空气微生物检测,沉降法检测程序,采样器消毒-倒平皿采样(30150L)-恒温箱(361，48h）-计算菌落数（cfu/m3）,根据平板上所生长的菌落数计算出1m3或1L空气中的细菌总数。,空气中微生物的测定方法,灭菌培养皿、天平、称量纸、恒温箱、培养基,实验器材,自然沉降法,(1)将肉汤蛋白胨琼脂培养基、查氏琼脂培养基、高氏一号琼脂培养基溶化后，各倒十五个平板，冷凝。可以同时检测空气中细菌、放线菌和霉菌浓度。,测定空气微生物的5点采样法,（2）在一定面积的房间内，按下图的5点所示，每种培养基每个点放三个平板，打开皿盖，暴露于空气中30分钟或60分钟后盖上盖子。（3）肉膏蛋白胨平板于37，倒置培养1天；查氏琼脂平板和高氏一号琼脂平板倒置于28培养分别培养2448h各自计算其菌落数，观察菌落形态、颜色。,（4）计算每m3空气中微生物的数量。面积为100cm2的平板培养基，暴露在空气中5分钟相当于10升空气中的细菌数。奥氏公式：,式中：C空气细菌数；A捕集面积，cm2；t暴露时间，min；N菌落数，个。,计算的浮游细菌数比实测的浮游细菌少。原因是此公式没有考虑尘埃粒子大小、数量、气流情况、人员密度和活动情况。,根据落菌数，记录空气中微生物的种类和相对数量，填写下表，推算出1m3空气中细菌数。空气微生物的测定结果,例：对火车站候车室进行5min检测，皿底直径为9mm的平板经3724h后所生长的菌落数为76个；请计算火车站候车室空气的微生物浓度，是否超过标准？,公共场所空气微生物标准（GB）9673-1996,室外空气污染：应采取预防为主，防止污染源扩散，控制污水回用和生物固体利用中生物气溶胶的传播，如在污水曝气池上安装隔离塑料膜，改喷灌为滴灌，以减少含菌气溶胶的传播。同时，对再生污水利用前应适当消毒。,室内空气：某些特殊的环境需进行空气净化与消毒，如洁净车间、微生物实验室、病房、外科手术室等。控制室内空气微生物污染常用下述几种方法。,2.空气的净化与消毒,在洁净车间、微生物实验室等应尽量减少人员的数目和走动，减少开关门的次数，以防止将地面微生物扬起和外界微生物的带入。对表面应进行湿式清扫。被污染的器皿及时灭菌。,控制室内空气微生物污染常用下述几种方法。,(1)控制污染来源,自然对流通风开窗通风以排除空气中微生物。,湍流通风效果优于自然通风，但远不及过滤层流通风。,过滤层流通风过滤器中的过滤介质多为醋酸纤维，空气穿过滤过层，能除去小到0.3m的粒子，过滤后的空气沿平行线以均匀速度流动，根据需要可设计成垂直式或水平式层流，可用于微生物操作的超净工作台、洁净病房和手术室。,(2)物理通风法,除菌效果：自然对流通风为17.4%，湍流通风为46.9%，过滤层流通风为96.7%。,(3)紫外线照射法,如紫外光照射的强度和时间得当，紫外光可以杀死几乎所有的传染因子，它更适用于手术室、病房、无菌实验室等处消毒之用。注意定期检测灯管照射强度，并注意人体的防护，防止臭氧污染。,使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。,(4)化学消毒剂消毒,常用的空气消毒化学药品有过氧乙酸、过氧化氢、乳酸、三乙烯乙二醇、丙二醇、次氯酸钠、甲醛（福尔马林）等。,过氧乙酸的分解产物是乙酸、过氧化氢、水与氧，这些都对人体无害。其缺点是已稀释的过氧乙酸易分解，宜临用时稀释配制，此外高浓度的过氧乙酸溶液对金属和纺织品有一定的腐蚀作用。,喷雾法消毒用510过氧乙酸溶液喷雾，如为80m3的房屋用100200mL，即可达到室内空气及物品表面消毒的目的。消毒后应密闭lh，经通风换气后再进入。,应用过氧乙酸消毒空气，通常有两种方式：,熏蒸法消毒将过氧乙酸水溶液置于耐腐蚀的容器中加热，使其产生过氧乙酸蒸气和水蒸气，使室内空气和物品表面达到消毒目的。过氧乙酸熏蒸用量为0.751g/m3，熏蒸后密闭lh。,第二节水中微生物控制技术,自来水厂常用的方法有：加氯消毒、臭氧消毒、紫外线消毒和微电解消毒。,1.目前最常用的是加氯消毒-液氯或漂白粉。,水中加氯后，生成次氯酸（HOCl）和次氯酸根（OCl-）。两者都有氧化能力，HOCl是中性分子，可能扩散到带负电的细菌表面，并渗入细菌体内，借氯原子的氧化作用破坏菌体内的酶，而使细菌死亡，而OCl-带负电，难于靠近带负电的细菌，所以虽有氧化能力，但很难起消毒作用。氯加入水中后,一部分被能与氯化合的杂质消耗掉,剩余的部分成为余氯。,(TJ20-76)规定的余氯量只能保证杀死肠道传染病菌,即伤寒、霍乱和细菌性痢疾等几种疾病。一般说，当水的pH值为7左右，钝化病毒所需的游离性余氯约为杀死一般细菌的220倍，其用量随病毒的种类而异，并与水温成反比。杀死赤痢阿米巴需游离余氯310mg/L左右，接触时间30min。而杀死炭疽杆菌可能需投加更多的氯。,我国生活饮用水卫生标准(TJ20-76)规定,氯接触30min后,游离性余氯不应低于0.3mg/L。集中式给水处理厂的出厂水除符合上述要求外,管网末梢的水的游离性余氯不应低于0.05mg/L。0.05mg/L余氯这个数字大致相当于5万个细菌重量的1000倍,所以即使每升水重新繁殖出5万个细菌,0.05mg/L的余氯还足以杀死它们。,干燥空气放电时，部分氧气即转化为臭氧，浓度可达25mg/L左右。只能现场制备，不能像液氯那样工业化生产，因此在费用上常高于加氯消毒。,2.臭氧消毒,优点：不会造成异臭异味;提高溶解氧量;氧化有机物等。,缺点：没有余量，也就没有后续的杀菌能力。,优点：经过消毒的水化学性质不变，不会产生臭味和有害健康的产物。缺点：因悬浮物和有机物干扰杀菌效果和费用较高，所以只适用于少量清水的消毒，如优质水及纯水的消毒。,3.紫外线消毒（有效波长在200300nm之间）,紫外线穿透的水层深度决定于灯输出的功率（以mWcm-2计）。,消毒机理：短波射线改变细胞组成，从而促使细胞突变死亡；紫外线的照射改变核酸分子的结构从而杀死细菌。,微电解H2O产生活性氧（如O2-、OH-）和H+。O2-和OH-具有强氧化能力，可杀死细菌及藻类。活性氧还可与水中氯离子作用生成HOC1，更增强了杀菌能力。活性氧还可氧化水中的NH3和NO2-为NO3-。,4.微电解消毒,微电解消毒法已应用于优质饮用水的消毒，尤其是桶装饮用水因为细菌数量极少，H2O2可起到抑菌和保质作用。也用于高层楼顶上水箱水的消毒和清除管道微生物垢。,H2O2是活泼的氧化剂，但H2O2不是对所有的微生物都起作用，有很多好氧菌和兼性厌氧菌都具有过氧化氢酶，能将H2O2分解为O2和H2O而使之失效。,饮用水中消毒剂常规指标及要求,国家标准：新标准执行时间为2007年7月1日,GB/T5749-2006中华人民共和国国家标准生活饮用水标准检验方法规定生活饮用水中微生物指标及限制为:细菌总数（CFU/mL）不得超过100个；总大肠菌群（MPN/100mL或CFU/100mL）不得检出；耐热大肠菌群（MPN/100mL或CFU/100mL）不得检出；大肠埃希氏菌（MPN/100mL或CFU/100mL）不得检出。,注：MPN表示最可能数；CFU表示菌落形成单位。当水样检出总大肠菌群时，应进一步检验大肠埃希氏菌或耐热大肠菌群；水样未检出总大肠菌群，不必检验大肠埃希氏菌或耐热大肠菌群。,第三节分质供水,按不同要求提供不同质量的自来水,深度制取的水用于烹调、饮用等，占每天用水量的5%；一般自来水用于洗碗、洗菜、洗衣等；中水用于冲厕所。分质供水既是解决水污染问题的需要，又是科技经济发展水平的体现。,一、分质供水方式,1.管道分质供水,深度处理或优质地下水,独立封闭管道,用户：社区、机关、学校质量要求：课直接饮用,优点：可有效监控生产过程可即时监测水质,2.水厂为用户配装家用净水器,市售家用净水器存在问题：水质针对性差、处理效果不理想、材料更换频繁。,如果水厂为用户提供配套净水器，可以较顺利地选用水处理材料和进出水系统，用于针对性的深度处理。,存在问题：人们认可度、信任度,3.桶装水,以符合生活饮用水卫生标准的水为原料,电渗析法离子交换法反渗析法蒸馏法其他方法,密闭于容器不含任何添加物可直接饮用的水,特点：基建成本低，但存放过久易造成细菌超标,合适老城区和经济欠发达城市中的居民采用。,二、分质供水的处理技术,传统工艺：混凝沉淀过滤消毒,去除对象：悬浮物胶体物少量小分子溶解物病原微生物。,去除对象：溶解性有机物重金属离子氯化消毒副产物,先进方法：反渗透法膜,缺点：成本较高，去除了有益的矿物质和微量元素,纯净水,普通自来水,根据水源水质分析，和不同地区水质特点采取适宜的处理工艺：,1、活性炭,作用：去除异味、吸附有机物和固定微生物,部分有机物可被微生物有效降解,对失效的活性炭可以进行再生，多次使用；净水