生物信息学在高通量测序数据分析中的应用.ppt

生物信息学在高通量测序数据分析中的应用,主讲人：李广林,提纲,高通量测序技术的介绍,高通量测序技术的主要应用,生物信息学在高通量测序数据中的主要应用,高通量测序简介,高通量测序:一次性对几百万到十亿条DNA分子进行并行测序，又称为下一代测序技术，其使得可对一个物种的转录组和基因组进行深入、细致、全貌的分析，所以又被称为深度测序。High-throughputSequencingNextGenerationSequencingDeepSequencing,3,主要测序技术,第一代测序技术Sangersequencing(1980s)第二代测序技术(nextgenerationsequencing,NGS)Roche/454(2005)Illumina/Solexa(2006)Life/APGsSOLiD(2007)Life/APGsIontorrent(2010)第三代测序技术PacificBiosciencessinglemoleculesequencing(2011)Nanoporesequencing,测序的基本反应原理：DNA聚合反应,第一代测序技术Sanger法,结合荧光标记和毛细管电泳,测序峰图,ABI3730sequencer,Readlength:1,000bpAccuracy:99.999%Cost:$0.5/kbThroughput:6x105bp/day,SangervsNGS,高通量测序技术Roche/454pyrosequencing,以固化了引物的玻璃微球为中心形成油包水结构的乳滴，每个乳滴都是一个PCR反应的微量反应器（通过控制测序文库DNA的浓度和微球悬浊液的浓度，保证大多数微球只结合一条DNA模板）。经过多轮循环反应，每个微球表面都结合了数千个相同的拷贝。变性后，使微球上结合的都是单链DNA片段。富集微球，转移到刻有大规模微孔阵列的微孔板上，每个微孔只容纳一个微球。,高通量测序技术Roche/454pyrosequencing,顺次向流通池中加入4种dNTP中的一种，流过微孔板的一面。当dNTP与脱氧核糖骨架连接后释放出焦磷酸，在与dNTP一起加入的ATP硫酰化酶和荧光素酶作用下产生一系列级联反应，放出不同的光信号。每个微孔中光信号的有无，就表明对应的dNTP是否连接到了片段上。,454测序的原理：焦磷酸测序,逐次加入dATP等，每加入一种，检测信号，清洗再加下一种。,ATP硫酸化酶,5-磷酰硫酸,荧光素酶,高通量测序技术Roche/454pyrosequencing,优势：读长长(max1kb,GSFLXTitaniumXL+)，运行时间短(10-23hours)主要错误来源：难以准确判定连续碱基（经过3次级联化学反应产生的荧光信号与连接上碱基的数量线性关系较差），容易产生Indel劣势：通量相对偏低(max700M)，单位成本高,GSFLX+System,GSJuniorSystem,高通量测序技术Illumina/Solexa,单链DNA两端加上非对称的通用接头(包括测序引物)，接头与事先固定在固相芯片表面的序列互补单链DNA结合到芯片表面形成桥式结构。然后使用接头引物进行PCR扩增变性后在一个芯片上可以形成上亿个不相关的单链DNA分子簇，其一端固定在芯片表面，另一端是自由的,高通量测序技术Illumina/Solexa,使用测序引物从自由的通用接头一侧开始测序反应。测序使用的dNTP每种碱基被不同的荧光基团标记，同时脱氧核糖的3-OH被封闭，这样每轮测序循环只能延伸一个核苷酸。读取碱基荧光信号，就能知道这一轮每个簇结合上的是什么核苷酸然后切除荧光基团，打开被封闭的3-OH，继续进行下一轮反应,Solexa测序的原理：可逆阻断,高通量测序技术Illumina/Solexa,优势：通量最高(max600Gb,HiSeq2500)主要错误来源：同一个簇内不同DNA链延伸情况不同（相位差），导致读取错误劣势：读长较短(max250bp,HiSeq2500)，运行时间长(1-14days，HiSeq2500大幅提升了运行速度)，数据存储和分析难度大。,MiSeq,HiSeq2000,GenomeAnalyzerII,高通量测序技术AB/SOLiD,SOLiDSystem,5500series,SOLiD测序探针介绍,类似454的微球反应体系，但使用连接反应。,SOLiDSequencing,每次测序反应的第1轮，测序引物1与接头序列互补形成平末端，然后与探针连接。当探针1,2位与待测序列模板互补并连接上之后，获取荧光信息。然后在探针的5,6位之间切开探针，进行下一个连接反应。这样重复多次，可以获得模板序列的第1-2,6-7,11-12位置的信息。,高通量测序技术Life/APGsSOLiD,优点：由于使用双碱基编码技术（two-baseencoding），准确率最高，通量高(max300Gb)缺点：读长最短(max75bp)，运行时间长(7-10day)，数据储存和分析难度大,5500SeriesGeneticAnalysisSystems,高通量测序技术Life/APGsIontorrentPGM,454发明者的新作品测序反应在微阵列芯片上的微反应池中进行。每个dNTP结合到延伸链上，会释放出一个H+，pH值变化会导致电位变化。检测每次dNTP流过的电位差变化，就能知道该dNTP是否连接上去。,高通量测序技术Life/APGsIontorrentPGM,优点：速度快(5%）的单核苷酸变异群体SNPcalling,ShortInDel检测,寻找SV(structurevariation),Copynumbervariation(CNV)需要一定的测序覆盖度(10 x)，mappingdepth也需要仔细检查,DGE,生物信息学在RNAomics方面的应用RNA高通量测序,DGE,RNA测序转录组测序,转录组测序简介,转录组即特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，包括mRNA和非编码RNA(Non-codingRNA)。第二代测序系统可精确检测单个碱基，并且不受到研究中先验信息的干扰，科研人员能够快速地获得某一物种特定器官或组织在某一状态下几乎所有mRNA转录本序列，从而能够开展：UTRs区域界定、可变剪切研究、低丰度新转录本发现、融合基因鉴定、cSNP（编码序列单核苷酸多态性）研究等。,转录组研究内容,转录组数据评估基因表达注释差异表达基因鉴定、聚类、Geneontology、KEGGpathway分析基因结构优化新转录本可变剪接融合基因SNP,转录组测序流程,无参考序列测序流程,有参考序列测序流程,转录组主要分析内容,基因融合分析,基因嵌合分析流程,MIPOL1-DGKB基因融合模式,Genomicintergenicregion,Readscluster,PairedReadsdistribution,优化基因结构鉴定新的转录本,Paired-End(PE)Reads,Reads比对到参考序列基因间区域,鉴定可变剪接（AlternativeSplicing）,exon1,exon2,exon3,exon1,exon2,exon3,exon1,exon3,commonreads,junctionreads,mRNA,分析RNA水平SNP,转录组重测序比对软件：SOAPDenovo转录组测序:组装软件：SoapDenovo比对软件：SoapSNP,DGE,RNA测序小RNA测序,SmallRNA:是长度在18-40nt的非编码RNA，在基因表达调控中发挥着重要的作用。,小RNA的产生,总RNA,通过切胶回收,测序,比对,注释和预测,SmallRNA测序,SmallRNA分析,smallRNA的长度分布；rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、miRNA、piRNA、siRNA的注释；物种特有的miRNA预测；miRNA的靶基因预测；对预测的靶基因进行GO分析和KEGG分析；对已知miRNA进行样品间差异分析和聚类分析。,SmallRNA研究技术比较,DGE,RNA测序降解组测序,降解组：含有5单磷酸的mRNA降解片段的集合。,降解组测序,高通量测序在RNA研究中的应用,64,PE,paired-endsequencing;SE,single-endsequencing;O,yes;X,no,ChIP-Seq,ChIP-ChromatinImmunoprecipitation染色质免疫共沉淀，是指通过蛋白免疫相互作用，用抗体把和染色质相互作用的蛋白，如组蛋白、转录因子等，沉淀下来，从而获取与其相结合的DNA序列。ChIP-Seq就是通过高通量测序对ChIP所得到的序列进行测序，从而进行蛋白和DNA相互作用研究。,ChIP-Seq测序流程,ChIP-Seq分析内容,ChIPSequencing结果与参考基因组序列进行比对ChIPSequencingreads