乙型脑炎减毒活疫苗

乙型脑炎解毒疫苗颐和老年人duhuoyimiaoJapanese Encephalitis Vaccine，Live本品将乙型脑炎(简称乙型脑炎)解毒株病毒接种原代小鼠肾细胞，培养、收获病毒液，加入适当的稳定剂冷冻干燥制备，预防乙型脑炎。1基本要求生产和检定用设施、原材料和辅助材料、水、器具、动物等应符合“图例”的要求。2制造2.1生产用细胞生产用细胞为原代大鼠肾细胞或连续代为5代以下的大鼠肾细胞。2.1.1细胞管理和鉴定必须符合生物制品生产和检定用动物细胞基质的制备和检定规程的规定。2.1.2细胞的制备选取1014日龄的清洁大鼠，无菌取肾，剪切，用胰蛋白酶消化，用培养液分散细胞，制备细胞悬浮液，分装培养瓶，在371下培养。 细胞生长成致密的单层后接种病毒。 同一批大鼠，同一容器消化制备的大鼠肾细胞是一个细胞消化批。 同一个大鼠出生，同一天制成的多个细胞消化批是一个细胞批。2.2毒种2.2.1名称和来源生产用毒种为乙脑病毒SA14-14-2减毒株。2.2.2创建种子批必须符合生物产品生产和检定用菌毒种管理规程的规定。原始种子批次代应不超过第六代，主要种子批次应不超过第八代，工种批次应不超过第九代，生产的疫苗应不超过第十代。2.2.3种子批的鉴定主种子批应进行以下全面检验，工作种子批至少应进行2.2.3.12.2.3.4项检验。2.2.3.1鉴别试验取毒种稀释10倍序列，以适当稀释度分别混合非同源性b脑特异抗体和b脑阴性血清，在37下作用90分钟，分别接种大鼠肾单层细胞或BHK21细胞进行中和试验，观察57天的判定结果。 中和指数必须大于1000。2.2.3.2病毒滴定将毒种稀释为10倍系列，至少采集3种稀释度的病毒液，分别接种BHK21细胞，用斑点法滴定。 冻干种子批次病毒的滴度必须在5.7 LgPFU/ml以上，液体种子批次病毒的滴度必须在7.2 LgPFU/ml以上。2.2.3.3无菌检查依法检验(附录XII A )应符合规定。2.2.3.4支原体检测依法检验(附录XII B )应符合规定。2.2.3.5病毒外源因子检测依法检验(附录XII C )应符合规定。2.2.3.6 E蛋白质基因稳定性试验e蛋白基因区核苷酸序列测定验证其遗传稳定性。 编码e蛋白基因区8个重要部位的氨基酸不变(E-107 :苯丙氨酸、E-138 :赖氨酸、E-176 :缬氨酸、E-177 :丙氨酸、E-264 :组氨酸、E-279 :蛋氨酸、E-315 :缬氨酸、E-439 :精氨酸)基因库中注册号D90195的b型脑炎减毒株SA14-14-2株与e蛋白基因区核苷酸序列的同源性在99.6%以上。2.2.3.7免疫原性检测用主种子批次制备疫苗，取10-3、10-4、10-5至少3个稀释度，分别免疫体重1012g的10只小鼠，皮下各注射0.1ml，免疫。 免疫后14在P3株乙脑强毒腹腔攻击，每只注射0.3 ml，其病毒量应在500腹腔滴定的LD50以上。 同时，小鼠脑内接种稀释液0.03ml。 攻击后14天的判定结果。 ED50在3.0 LgPFU以下，攻击对照组的小鼠死亡率应在80%以上。2.2.3.8猴体神经毒性试验采用冻干主种子批进行猴体神经毒性试验。 将主种子的分批毒种(病毒滴度在5.7 LgPFU/ml以上)注射到10只恒河猴的两侧床各0.5ml和腰部脊髓内0.2ml。 对照组用强毒SA14株稀释至102PFU/ml和103 PFU/ml病毒量，同样方法接种猴子，每稀释度注射4只猴子，注射部位为同一试验组。对SA14-14-2减毒株组10只猴子至少观察21天，无特异性乙脑发病症状，组织学检查注射部位、脑和脊髓仅出现微小炎症反应。 对照组SA14株在注射后8天内病毒量103 PFU/ml组的4只猴子全部死亡病毒量102 PFU/ml组的4只猴子，至少应该有2只死亡。 组织学检查表现的主要特点是神经细胞坏死，炎症反应少。2.2.3.9脑内致病力试验以种子毒种接种体重1214g小鼠，至少10只，脑内注射0.03ml，观察生存14天。 接种后3天内死亡人数不算，但3天内死亡人数不得超过20%。 如果3天后老鼠发病，死刑后要取脑，测定病原力。 小鼠脑内毒性在3.0 LgLD50/0.03ml以下，同时用10-1病鼠脑悬液皮下注射10只体重1012g的小鼠，每只0.1ml，观察14天，均应健康。2.2.3.10皮下感染入脑试验以种子批毒种接种体重1012g小鼠10只，皮下每只注射0.1ml，同时右侧脑内有刺，观察14天，均须健康。2.2.3.11乳鼠继代归祖考以病毒滴度为7.2 Lg PFU/ml以上(液体毒种)或5.7PFU/ml以上(冷冻干燥毒种)的种子批次毒种接种35日龄的10只小鼠，脑内注射0.02ml。 将发病小鼠处死3只，解剖脑，用体重1214g的小鼠测定病原力，脑内毒性应在3.0 LgLD50/0.03ml以下，同时用10-1发病小鼠脑悬浮液皮下注射10只体重1012g的小鼠，每只0.1ml，观察14天2.2.4毒种保存毒种请保存在-60以下。2.3原液2.3.1细胞的制备同样的2.1.2项。2.3.2培养液培养液是含有适量除去能力的新生牛血清的乳蛋白水解物Earle氏液或其他适当的培养液。 被用于细胞培养。 新生牛血清质量应符合要求(附录XIII D )，乙脑抗体应为阴性。2.3.3对照细胞外源因子检测依法检验(附录XII C )应符合规定。2.3.4病毒的接种和培养选择致密的单层细胞，用洗涤液充分洗涤后，加入适量的维持液，用0.001MOI接种病毒，在361下培养。2.3.5病毒的收获培养72小时左右，细胞发生病变时收获病毒液。 根据细胞的生长状况，可以用维持液继续培养，多次收获病毒液。 同一细胞批次的同一病毒收获液经检定合格后可合并成单一病毒收获液。2.3.6单次病毒收获液鉴定在3.1项中进行。2.3.7单次病毒收获液的保存在2-8下保存30天以内。2.3.8合并单次病毒收获液同一细胞批次的多次单次病毒收获液经检定合格后，明确过滤，合并成一批原液。2.3.9原液检定在第3.2款中进行。2.4半成品2.4.1调制用疫苗稀释液按同一病毒滴度适当稀释原液，加入适量稳定剂是半成品，每批半成品总量不得超过150，000 ml。2.4.2半成品检定在第3.3项中进行。2. 5成品2.5.1批次必须符合生物产品分批规程的规定。2.5.2分注和冻干应符合生物产品分装和冻干规程的规定。 分装中的疫苗半成品放置在2-8。2.5.3规格以显示量再溶解后，每瓶0.5ml、1.5ml、2.5ml。 每次用量为0.5ml，乙型脑炎发生病毒应在5.4 Lg PFU以上。2.5.4包装必须符合生物产品包装规程的规定。3检定3.1单次病毒收获液检定3.1.1病毒滴度按照2.2.3.2项进行，病毒滴度应在7.0 Lg PFU/ml以上。3.1.2无菌检查依法检验(附录XII A )应符合规定。3.1.3支原体检测依法检验(附录XII B )应符合规定。3.2原液检定3.2.1病毒滴度按照2.2.3.2项进行，病毒滴度应在7.0 Lg PFU/ml以上。3.2.2无菌检查依法检验(附录XII A )应符合规定。3.2.3支原体检测依法检验(附录XII B )应符合规定。3.2.4逆转录酶活性检测根据本标准的附录，应为阴性。3.3半成品检定3.3.1病毒滴度按2.2.3.2项进行，病毒滴度应不低于6.8 Lg PFU/ml。3.3.2无菌检查依法检验(附录XII A )应符合规定。3.4成品检定除水分测定外，按照显示量加入疫苗稀释剂，再溶解后，进行以下各项检定。3.4.1鉴别试验在2.2.3.1项下进行。3.4.2外观应为淡黄色疏体，再溶后为橙色或淡粉色清液，无异物。3.4.3水分请控制在3.0%以下(附录VII D )。3.4.4病毒滴度按2.2.3.2项进行，病毒滴度为5.7 Lg PFU/ml以上。3.4.5热稳定性试验疫苗在出厂前应进行热稳定性试验，与病毒滴定同时进行。 在37下放置7天，按照2.2.3.2项进行，病毒滴度必须在5.7LgPFU/ml以上，病毒滴度必须在1.0 Lg PFU/ml以下.3.4.6安全试验3.4.6.1脑内致病力试验同样的2.2.3.9项。3.4.6.2乳鼠继代归祖考同样的2.2.3.11项。3.4.7无菌检查依法检验(附录XII A )应符合规定。3.4.8异常毒性检测依法检验(附录XII F )应符合规定。3.4.9牛血清白蛋白残留量不超过50ng/剂(附录VIII F )。3.4.10抗生素残留量检验生产细胞制备过程中加入抗生素的检测应用ELISA法测定，在10ng/ml以下。4保存、运输和有效期在28时避光保存、运输。 自生产之日起，有效期为18个月。5疫苗稀释剂疫苗稀释剂为灭菌注射用水或灭菌PBS，应满足疫苗稀释剂的