乙型肝炎病毒在肝外组织中复制并影响血糖调节

乙型肝炎病毒在肝外组织中复制影响血糖控制【摘要】目的研究肝外组织是否支持乙型肝炎病毒复制，以及乙型肝炎的泛嗜性对血糖控制的影响。方法：通过PCR方法对鸭血清中鸭乙型肝炎病毒检测，筛选出携带鸭乙型肝炎病毒的鸭，进行分组后静脉内葡萄糖耐受检测。用共价闭环DNA作为滚动环扩增法，分别提取鸭乙型肝炎病毒鸭的肝、胰、肾和肌肉组织的总DNA，确定肝、胰、肾和肌肉是否有鸭乙型肝炎病毒复制。利用SPSS的ANOVA分析鸭血糖与鸭乙型肝炎病毒携带关系，血糖与鸭乙型肝炎病毒在胰、肾、肌肉中复制的关系。结果：按PCR筛选36只鸭乙型肝炎病毒鸭，60只阴性鸭，阳性率为37.5%。携带DHBV鸭子的肝、胰、肾和肌肉的复制标记共享结合环DNA的检出率分别为100%、55.6%、66.7%和44.4%。携带鸭乙型肝炎病毒的鸭子空腹，0.5小时，1小时，2小时血糖浓度平均值高于携带鸭乙型肝炎病毒的鸭子，感染肾脏和肌肉的鸭子的血糖平均值比最后感染的鸭子稍高，但没有统计意义。感染胰腺的鸭子空腹，0.5小时，1小时，2小时血糖浓度的平均值高于最后感染的鸭子，统计注意(P0.05)。结论：乙型肝炎病毒肝外组织可以支持复制乙型肝炎病毒，这是感染胰腺的乙型肝炎病毒导致糖耐量紊乱的原因之一。关键词乙型肝炎病毒；泛湖性；血糖控制HBV replication in extra hemic tissues and impactIn the Blood Glucose Regulationabstract object this study attempts to investiga whether The extra hepatic suports The replication of HR onic hepatitis b virus(HBV)，Andthe total DNA of hepatic tissues，pancreas，Kidney and muscle of duck with dhbv were extracted，Then using rolling circle of amplifationthe relation between the blood glucose regulation and the dhbv replication In hepatic，pancreas，Kidney and muscle was evaluated by the anooresults total 36 ducks were screened The positive for dhbv and 60 ducks were negative，The positive rate of ducs with dhbv were 37.5%。The detection rate of hepatic tissues，pancreas，kidney and muscle of dhbv CCC DNA were 100%，55.6%，66.7%，44.4% redthe averagages of blood Glu cose concentration of duck wh ich ccdna screened was positive in pancreas was higer than that ccdna screened was negativeconclusions HBV can replicated in extra hepatic tissues and HBV infection pancreas are attributable to the impaired glucose tolerance。Key words hepatitis b virus、extra hepatic tissues、blood glucose regulation世界卫生组织统计，全球有3亿5000万名慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者，而我国HBV感染率高的1亿3000万名HBV表面抗原阳性，导致每年约30万1-3的人死亡。据研究，慢性活动性肝炎会引起肝仁性糖尿病、肾炎、消化系统疾病等多种并发症4，5，其中肝仁性糖尿病是乙型肝炎患者常见的并发症，乙型肝炎患者并发糖尿病的概率为9%-16%6。但是其病因还不清楚。目前，很多科学研究已经确认可以在肝外组织检测出HBV，但由于乙型肝炎病毒存在于血液中，因此各肝外组织检测出的HBV DNA是否存在于肝外组织细胞或肝外组织血液中，还没有明确定义。DHBV(duck hepatitis B virus，DHBV)和HBV都具有相似的基因组和病毒结构特征和RNA逆转录复制功能，DHBV不受主机组织中细胞来源的限制，因此DHBV复制机制的特征基于DHBV复制研究的基础7。该研究计划以携带DHBV的鸭子作为实验动物，调查肝外组织是否支持乙型肝炎病毒复制，以及乙型肝炎病毒的泛嗜性对血糖控制的影响。1材料和方法1.1材料1.1.1主要试剂QIAamp DNA Micro套件是从德国Qiagen购买的。Taq DNA Polymerase，2Taq PCR MasterMix是从北京天根生化技术公司购买的。北京北华康泰临床试剂有限公司购买的葡萄糖套件；胰腺rnasa、牛血清标准蛋白、质粒DNA少量提取套件、柱DNA胶回收套件和一般生物化学试剂购自上海生物工程技术公司、乙醇75%、广东精细化工技术研发中心；P hi29 DNA聚合酶是在Fermentas购买的。复制载体pGEMTeasy是在美国Promega购买的。引物是用上海生物工程合成的。1.1.2底漆根据GenBank公布的DHBV基因全长序列筛选携带DHBV鸭的引物Ps1和Ps2的相关文献设计和DHBV部分s基因的扩增；按照DHBV高度保守的顺序设计了四对RCA引物RCA 1-8，与DHBV的正负链相补充。此外，还设计了一对引物DP1和DP2，用于在槽口之间放大DHBV，一对引物PK1和PK2和DHBV。引物序列及位置见表1，由上海生物技术有限公司合成。表1 DHBV引物序列列表引物的名字引物序列位置Ps15 -agctgcctmaggattac-3Nt1319-1338Ps25 -tgtccgtcagatcaag-3Nt1581-1562RCA15 -aattctcgaata * c * t-3 Nt1361-1375RCA25 -gatccgaggcag * t * a-3Nt1668-1654RCA35 -ccaatgggagg * g * t-3Nt1610-1624RCA45 -tacacogtgcaaa * g * g-3Nt2164-2150RCA55 -ctgtacctgcc * a* c-3Nt2145-2159RCA65 -ccgcaattctc * c * a-3Nt1912-1898RCA75 -tagaagaaga * g * t-3Nt267-281RCA85 -agtaaatggtaac * a* c-3Nt2005-1991PK15 -ccaacacatggcgcaattc-3Nt2180-2199PK25 -gcctaaggtatctcag-3Nt2958-2939注：*为硫磺打碱1.2方法1.2.1鸭血清中DHBV的提取和检测鳍静脉取鸭全血分离血清。100 L血清沸水浴10分钟后12，000g离心10分钟。PCR反应系统是2Taq PCR MasterMix 12.5 L、10毫米引物Ps1、Ps2分别加0.5 L、Taq DNA聚合酶0.5 L、上述上清液5 L、灭菌双蒸气数为25L。扩增条件为94 3分钟。94 到30s，56 到40s，72 到30s，共35个循环；72 7分钟，68 10分钟。来筛选携带DHBV的鸭子。放大长度为262bp。1%琼脂糖电泳试验结果。1.2.2静脉葡萄糖耐受试验鸭子饿了一夜后，测量鸭子的重量，计算出需要注射的葡萄糖，准备好。翼静脉采集鸭全血后，注射准备好的葡萄糖，记下时间。然后在0.5h，1h和2h处采集血液。4000 rpm离心10分钟，取上等液到其他离心管。血糖浓度是按照葡萄糖套件(氧化酶法)的说明测量的。其余血清放在-20 保存储备。1.2.3 DHBV鸭子的DHBV DNA提取解剖每只携带DHBV的鸭子，获得适当数量的肝、胰、肾和肌肉组织，冲洗PBS后保存在液氮中。DHBV cccDNA是从4个组织中提取的，每个组织根据QIAamp DNA Micro文档进行提取。将备件保存到-20 。1.2.4滚动环放大分别以8.5 L鸭血清DHBV DNA、肝组织总DNA和肝组织DHBV DNA为模板，混合在29 DNA聚合酶buffer 1 L、4对RCA底漆混合物20 10 min/L) 0.5 L、PCR测量仪中，95 3在上述产品中，29 DNA聚合缓冲1 L、4对RCA底漆混合物(10 mol/L) 0.5 L、BSA (5 mg /mL) 0.2 L、dNTP (2.5 mmol/L)1%琼脂糖电泳试验结果-20 初步储存。1.2.5十字槽底漆PCR放大根据DHBV的正负链间隙设计十字槽底漆，PK1和PK2底漆序列如图1所示。PCR反应系统将2Taq PCR MasterMix 12.5 L、10毫米底漆PK1、PK2分别添加为0.5 L、Taq DNA聚合酶0.5 L、上述RCA产品1 L、灭菌双蒸汽25 L。反应条件如下：94预变性3分钟；94 到40 s，56 到30 s，72 共35个循环1分钟；72 5分钟。放大长度为779 BP。1%琼脂糖电泳试验结果。2结果2.1鸭血清中DHBV的提取和检测用PCR方法筛选96只鸭子，从36只血清中检测出携带DHBV的鸭子的阳性率为37.5%。部分血清检查结果在图1中，扩增片段大小约为262bp，阳性血清扩增正常阳性条，阴性血清没有扩增带。图1 DHBV阳性鸭电泳的PCR筛选被检查鸭子的血清扩增产物“和“-”分别是阳性血清的扩增产物和阴性血清扩增产物。2.2滚动环放大图2显示了用RCA方法扩增同一只阳性鸭子的血清DHBV DNA、肝脏、胰腺、肾脏和肌肉组织的DNA的一些实验结果。在血清中，DHBV作为rcDNA存在，没有带，而在肝细胞中，DHBV作为cccDNA存在，与预期相符的扩增效果更好。图2血清、肝、胰、肾和肌肉滚动放大电泳2.3槽口引物PCR放大同鸭血清DHBV DNA、肝、胰、肾和肌肉组织的RCA产品中，分别以0.5uL为模板，其中语音对照组以水为模板，用PCR作为交叉切口引物