干细胞库,免疫细胞与干细胞的区别

什么是干细胞库，干细胞实体库，干细胞资料库？干细胞库是在约为196液氮中（深低温）储存干细胞或相关资料的场所。一个完善的干细胞库应具备随时随地将健康干细胞提供临床使用的能力。按所储存的干细胞来源和采集方式，干细胞库分为脐血干细胞库、骨髓和外周血干细胞库。脐血干细胞库所做的工作是将新生儿的脐血采集后经过分离冷冻并储存起来。在每份脐血中，大约含数百万个干细胞，足够供一个幼儿或少年患者使用。如果是在成年后发病，一份脐血所提供的干细胞数量就不够用了，但是将来可以通过干细胞的扩增技术得到解决。骨髓和外周血干细胞库可分为资料库和实物库。资料库所做的工作是将健康者提供的骨髓或外周血干细胞进行HLA配型和资料登记，待需要时再采集其骨髓。实物库则是在进行细胞配型和资料登记的同时，采集和储存健康提供者可供移植用的骨髓或外周血干细胞。干细胞库按提供方式又分为公共库和自体库。公共库所储存的干细胞是他人的干细胞，以满足需要移植但自体干细胞没有被保存的病人的需求。自体库则是储存在自己出生或健康时采集的部分干细胞，以备自己生病时用。目前，自体脐血储存多由父母为子女来做。目前我国的干细胞库主要有中国造血干细胞捐献者资料库和脐血库。这两类干细胞库的不同在于，中国造血干细胞捐献者资料库(中华骨髓库)是中国红十字会发起建立的，主要对自愿捐献者进行白细胞抗原配型和资料登记，将来需要时再采集骨髓，是一种资料库。脐血库是实物库，即通过对新生儿脐血进行配型和资料登记，同时采集储存可供移植用的干细胞，一旦需要，这些干细胞即可用于临床移植。资料库的建库方法，主要是对捐献者进行白细胞抗原配型，HLA抗原（白细胞抗原）是人类主要组织相容性复合物抗原。它们与同种异体移植中的排斥反应有密切关系。HLA是由 HLA基因复合体所编码的产物，HLA复合体是人类中最复杂的基因复合体，其遗传主要特点是共显性复等位基因遗传，是调节人体免疫反应和异体移植排斥作用的一组基因，位于第六号染色体的短臂上。每个座位上的 HLA基因均可编码一种特异性抗原，主要表达在细胞膜上，或以游离状态存在于血液和体液中。HLA抗原可根据不同基因位点的产物和它们的功能加以分类。目前研究较充分的有HLA-A，B，C，D，DR，DQ和DP七个位点。每个位点上均有很多等位基因，为共显性复等位基因。目前已确定HLA复合体共有1028种等位基因。其中，HLA-A、B、C座位上的基因编码的抗原成分称为 I类抗原。I类抗原是一种膜糖蛋白，存在于所有有核细胞的膜上，以淋巴细胞上的密度最大。 II类抗原是由 HLA-D、DR、DQ、DP座位基因所编码的抗原。它是由两条糖基化的跨膜多肽链构成，分别称为链和链，其抗原特异性主要与链有关；主要表达在 B细胞、巨噬细胞和其他抗原递呈细胞上。第一类抗原： HLA-A，HLA-B，HLA-C第二类抗原： HLA-D，HLA-DR，HLA-DQ，HLA-DP第三类抗原： C4A，C4B，C2，Bf等补体成分通过遗传，人每套染色体有两条，一条来自父亲，一条来自母亲。每个位点含有两个等位基因，一个来自父亲，一个来自母亲。两个等位基因是相互独立的，既一个基因不能抑制另一个基因的表达。某一个体，如果一个位点的两个基因是不同的，称为杂合子基因；如同一位点具有同样的等位基因，称为纯合子基因。HLA位点具有众多的等位基因，造成HLA的极端多态性。HLA分型方法包括血清学分型、细胞学分型和基因分型。血清学和细胞学分型技术主要侧重于分析HLA抗原的特异性，基因分型方法则侧重于分析基因本身的多态性。细胞学分型技术由于分型标准细胞来源困难，且方法繁琐，不适于常规检测使用，正渐被淘汰。一、 HLA血清学分型方法（一）淋巴细胞分离淋巴细胞分离的方法很多，主要有直接沉淀法、密度梯度分离法、细胞分离器法和免疫磁珠法等。现国内大多数实验室多采用密度梯度法，而有条件的实验室已采用免疫磁珠法分离淋巴细胞。免疫磁珠法分离T、B淋巴细胞，FluoroBeads是一种可荧光染色的免疫磁珠，由特异性的单克隆抗体和可磁化的金属颗粒结合而成。磁珠磁化后，受磁力的吸引可被分离。当磁力移开后，磁珠不会带有磁力但可被反复磁化。已和磁珠结合的特异性单克隆抗体和相应的淋巴细胞结合，既可分离淋巴细胞。（二）微量淋巴细胞毒实验这是一种补体依赖性淋巴细胞毒实验。该方法目前仅用一微升抗体、一微升细胞、一微升补体，孵育一小时。即抗原+抗体+补体结合。故称快速微量淋巴细胞毒实验方法。 淋巴细胞具有HLA抗原，在补体存在的情况下，HLA细胞毒抗体(IgG,IgM)能够结合到带有相应抗原的活淋巴细胞膜上，并在膜上打洞致淋巴细胞死亡。如淋巴细胞不带有相应的抗原，则无此作用。死细胞可用数种方法观察到，最简单的方法是染色法。染色液可通过死细胞膜进入细胞内，以便细胞着色。目前常用的染料为荧光液和曙红(CFDA和EB)。在荧光显微镜下，活细胞呈绿色(CFDA与细胞膜结合)，死细胞呈红色(EB可通过被破坏的细胞膜进入细胞与DNA结合)；在相差显微镜下，活细胞因不被着色而明亮，死细胞由于曙红进入细胞而色暗无光。估计死细胞占全部细胞的百分比，可以反映出抗原与抗体反应的强度。目前，国际通用的判断方法为NIH计分法。在T和B淋巴细胞上都存在HLA-A，B，C抗原，因此检测这些抗原一般可直接用淋巴细胞。但是某些HLA-A，B，C分型血清中同时存在DR抗体，所以，为了避免DR抗体可能造成的干扰，通常用T淋巴细胞做ABC分型。近几年，HLA单克隆抗体的出现，可避免DR抗体的影响，而可用总淋巴细胞检测HLA-A，B，C分型。HLA-DR，DQ抗原存在于B淋巴细胞上。所以，测定HLA-DR，DQ抗原时，需从总淋巴细胞中分离出B淋巴细胞进行测定。（三）HLA抗原血清学分型现状血清学分型技术创立30多年，在研究HLA的多态性及其功能意义，器官移植组织配型，尤其是筛选异基因骨髓移植无关供体，建立“骨髓库”等方面发挥了主要作用。同时，血清学分型技术本身也得到了迅速发展：1分型技术微量化 一微升抗体，一微升细胞，一微升补体，成为国际通用的标准技术。2交流标准细胞株和交换标准抗血清的国际大协作，基本上满足了不同地区、不同种族的人群HLA分型的要求。HLA领域的国际大协作是迄今为止各类技术合作中最有效、最成功的典范。3分型技术与方法得到了进一步完善。如：1）1994年美国加州大学组织配型中心建立了单克隆抗体技术用于标准抗血清的筛选，大大提高了标准抗体的特异性，简化了抗血清筛选的程序。同时，采用单克隆抗体干板代替血清板，更利于运输和保存。2）同期建立的免疫磁珠淋巴细胞分离技术，使T淋巴细胞和B淋巴细胞的分离简捷、快速，特异性更强。3）快速荧光染色技术的发展，使计算机读板成为可能。4自动化程序提高 目前从加样到读板均已实行自动化操作，大大提高了工作效率，使大批量样本的HLA分型成为可能。如UCLA配型中心周处理样本量可达到数千份到10000份。这是其他HLA分型技术难以做到的。HLA血清学分型技术成熟，操作简捷、快速，标准化和自动化，对HLA-类A、B抗原分型结果基本可靠，仍然是目前HLA分型，尤其是HLA-类抗原分型技术的主要方法之一。（四）血清学分型技术的局限性尽管血清学技术对HLA-类抗原分型结果有较高的准确性，提供了组织配型的基本手段，并有力推动了HLA研究的发展。但血清学方法也存在诸多的限制。1随着分子生物学技术的发展，对HLA分子结构与核苷酸序列分析研究的深入，每年都有许多新的等位基因特异性被发现和确定。血清学方法已经无法获得能够分辨出所有特异性的标准抗血清。2HLA等位基因序列的高度同源性，使血清学出现较多、较强的交叉反应，影响了分型结果的准确性，并使亚型的进一步确定带来困难。如B40、B48同时存在时，确定B60、B61、B48较为困难，常常只能根据不同人群种族与地域的抗原频率分布高低来判断。存在B62时，B71就难以分辨出来。A19分裂子的判断也常常出现误差。3分型血清本身的问题： 类分型血清一般比较弱，容易出现假阴性反应； 相当多的类分型血清是用血小板吸收去除类抗体的方法得到的，可能造成抗体效价的下降，同时残留的类抗体也可以干扰分型结果。4HLA-C抗原血清学分型，至今缺乏理想的单特异性的抗血清。5血清学方法检测的是淋巴细胞膜表面的HLA表现型。血清学的表型相同，DNA核苷酸序列不一定完全相同。HLA的个体遗传学差异的本质不是在血清学方法所检测的基因产物上，而是在编码基因产物的DNA水平上。6淋巴细胞膜抗原的表达受多种因素的影响与干扰。最近的研究显示：膜上的HLA抗原有可能被遮盖或表达能力下降。如HLA-C抗原等位基因序列目前血清学尚不能分辨，淋巴细胞膜表面C抗原表达只有A抗原或B抗原的10%。7HLA-类抗原主要在B淋巴细胞表达，血清学分型较类A、B抗原误差率更高。8目前用于血清学分型的抗血清或单克隆抗体，主要依据白种人群的HLA背景与频率分布特点而定，中国人的标准抗血清很少。因此，源于白种人群的血清学分型用于非白种人群的检测，本身就存在一定的误差。9标准抗血清或单克隆抗体的筛选技术复杂，难度大，试剂来源受到限制。10血清学需要活的淋巴细胞，对于特定条件下的尸体移植，样本的来源受到一定的限制。综合DNA分型与血清学分型结果，结合我国器官移植的实际情况，1）HLA-I类A、B抗原分型仍以血清学方法为主，尤其是大样本量的检测，如建立“骨髓库”，更适用于血清学分型作为初步筛选。对于血清学分型困难、空白或交叉反应明显，影响亚型确定者，有必要采用DNA分型作进一步确认。2）HLA-II类抗原尤其是DR抗原分型，推荐采用DNA分型技术取代血清学方法。二、HLA基因分型方法HLA基因分型是在编码基因产物的DNA水平上，因此自90年代以来，DNA水平的HLA分型研究，尤其是HLA II类抗原的DNA分型研究，发展十分迅速，并在临床器官移植的组织配型中得到实际应用。HLA的DNA分型方法很多，各有其特点。目前常用的方法大致可分为五大类。（一） 限制性片段长度多态性分析RFLP方法的基本原理与技术是根据HLA(主要是II类抗原)的核苷酸序列，在不同部位存在多个不同的酶切位点，利用核酸内切特异性消化和切割这些位点，形成各种大小不等的DNA片段，经电泳分离再转移到硝酸纤维素滤膜(NC膜)上，与cDNA探针杂交，采用放射性自显影技术观察分型结果。PCR-RFLP技术进行HLA分型，大大提高了分型方法的敏感性和精确性，并缩短了检测时间。但复杂的分型方法学和复杂的结果判断程序，限制了PCR-RFLP技术的广泛应用。（二）聚合酶链反应单链构象多态性分析PCR-SSCP系Drita等1989年首先提出，其方法原理可概括为：在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，单链DNA因碱基序列不同所形成的构象不同，泳动速度也不同。通过PCR扩增包括发生单个碱基置换部位及两侧DNA片段，变性后进行SSCP分析，可分辨出单个碱基的改变，有效地检出点突变和DNA的多态性。主要步骤包括PCR扩增，产物酶消化切割，热变性为单链DNA，电泳后染色观察结果。主要应用于检测癌基因的突变和HLA多态性。在要求精确配型的异基因骨髓移植中，PCR-SSCP已初步显示出优越性。但在实质性器官移植的临床配型中，如同RELP一样，构象分析的主要问题也是检测技术与结果的判断程序太复杂，影响了该项技术的实际应用。（三）聚合酶链反应寡核苷酸探针杂交方法PCR-SSO方法是目前最常用的DNA分型技术之一。主要技术包括提取模板DNA，以位点间或组间特异性引物进行PCR扩增，其产物转移到NC膜上，再与数十个寡核苷酸特异性探针杂交，从而分辨出等位基因的特异性。 SSO分型除存在杂交污染外，与SSCP一样，并不能对所有等位基因多态性均作出精确的分辨。（四）DNA序列测定采用自动测序仪对HLA分子的核苷酸碱基序列测定是目前HLA分型最直接、最精确、最可靠的方法。常用于对新发现的HLA特异性进行DNA序列分析。但所需设备昂贵，检测时间长，即使采用全自动测序仪，目前每天也只能完成5份样本的HLA-I类、II类分型。（五）序列特异引物聚合酶链反应技术根据HLA 抗原的核苷酸序列，设计出一系列针对各亚型 的顺序特异引物，通过PCR扩增各等位基因的型别特异性DNA片段；扩增产物借助常规的琼脂糖凝胶电泳，即可根据是否存在特异性扩增产物的电泳条带直接进行分型。该方法已被大多数HLA实验室所采用。PCR-SSP技术的显著特点是结果容易判断、根据实际需要调整分辨度水平、分型速度快，特别适用于尸体移植。（六）应用寡核苷酸芯片技术进行HLA I、II类抗原的分型HLA I类、II类抗原中的A、B、DR、DQ等位点是器官移植中主要应用的免疫排斥相关的配型位点，以往对I类抗原分型主要是血清学分型，成本高，存在交叉反应；对二类抗原主要是用PCR-SSP方法，一次需进行十几管或几十管PCR反应，操作复杂且易产生假阳性和假阴性，影响结果判断的可靠性。基因芯片由于其本身的技术特点，一次可以在芯片上放上成千上万的不同的基因片段，因此一次可以检测多种突变位点，对于HLA来说，理论上可以实现在一块芯片上同时探测A、B、DR、DQ等所有已知的多态位点，是一种理想的高效的检测配型手段，在方法学上具有不可替代性。三、HLA交叉反应组 (CREG)目前，临床HLA配型常规检测的HLA抗原有100种左右。在这100种抗原中，供者与受者HLA抗原相同的机率很低。然而，许多HLA抗原在分子结构上具有相同部分，称为公共抗原决定族。既某些抗原因为分子结构接近，而发生与某一抗体的交叉反应。这些抗原被称为交叉反应组(Cross Reactive Group，CREG)。根据CREG的不同，可将目前常规检测的100种HLA抗原分为10个CREG。大量临床数据表明，在同一CREG中，即便供者和受者的抗原不同，其发生移植后免疫排斥的机率明显低于非同一CREG中的HLA抗原错配。而器官移植存活率也明显高于随机HLA抗原错配的患者。因此，有人称此为可接受错配。例如，供者的HLA-A位点的抗原为A3，受者HLA-A位点的抗原为A11。由于A3和A11均属于CREG分类中的A01C，所以供者对受者无异体的CREG。其移植存活率虽不如A3与A3，或A11与A11的配型关系，但可明显高于非同一CREG的错配。免疫细胞和干细胞的区别与联系？免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞。免疫细胞是白细胞的俗称，包括淋巴细胞和各种吞噬细胞等，也特指能识别抗原、产生特异性免疫应答的淋巴细胞等。淋巴细胞是免疫系统的基本成分，在体内分布很广泛，主要是T淋巴细胞、B淋巴细胞受抗原刺激而被活化，分裂增殖、发生特异性免疫应答。除T淋巴细胞和B淋巴细胞外，还有K淋巴细胞和NK淋巴细胞，共四种类型。T淋巴细胞是一个多功能的细胞群。除淋巴细胞外，参与免疫应答的细胞还有浆细胞、粒细胞、肥大细胞、抗原呈递细胞及单核吞噬细胞系统的细胞。T细胞即胸腺依赖淋巴细胞。亦可简称T细胞。来源于骨髓的多能干细胞（胚胎期则来源于卵黄囊和肝）。目前认为，在人体胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多能干细胞或前T细胞迁移到胸腺内，在胸腺激素的诱导下分化成熟，成为具有免疫活性的T细胞。成熟的T细胞经血流分布至外周免疫器官的胸腺依赖区定居，并可经淋巴管、外周血和组织液等进行再循环，发挥细胞免疫及免疫调节等功能。T细胞的再循环有利于广泛接触进入体内的抗原物质，加强免疫应答，较长期保持免疫记忆。B细胞是来源于骨髓的多能干细胞，是由骨髓中的淋巴干细胞分化而来。与T淋巴细胞相比，它的体积略大。这种淋巴细胞受抗原刺激后，会增殖分化出大量浆细胞。浆细胞可合成和分泌抗体并在血液中循环。在哺乳类是在类囊结构的骨髓等组织中发育的，又称骨髓依赖淋巴细胞。从骨髓来的干细胞或前B细胞，在迁入法氏囊或类囊器官后，逐步分化为有免疫潜能的B细胞。成熟的B细胞经外周血迁出，进入脾脏、淋巴结，主要分布于脾小结、脾索及淋巴小结、淋巴索及消化道粘膜下的淋巴小结中，受抗原刺激后，分化增殖为浆细胞，合成抗体，发挥体液免疫的功能。B细胞在骨髓和集合淋巴结中的数量较T细胞多，在血液和淋巴结中的数量比T细胞少，在胸导管中则更少，仅少数参加再循环。K淋巴细胞又称抗体依赖淋巴细胞，直接从骨髓的多能干细胞衍化而来，表面无抗原标志，但有抗体IgG的受体。发挥杀伤靶细胞的功能时必须有靶细胞的相应抗体存在。靶细胞表面抗原与相应抗体结合后，再结合到K细胞的相应受体上，从而触发K细胞的杀伤作用。凡结合有IgG抗体的靶细胞，均有被K细胞杀伤的可能性。因此，也可以说K细胞本身的杀伤作用是非特异性的，其对靶细胞的识别完全依赖于特异性抗体的识别作用。K细胞约占人外周血中淋巴细胞总数的510%，但杀伤效应却很高。当体内仅有微量特异性抗体，虽可与抗原结合，但不足以激活补体系统破坏靶细胞时，K细胞即可发挥其杀伤作用。K细胞在腹腔渗出液、脾脏中较多，淋巴结中较少，胸导管淋巴液中没有，表明K细胞不参加淋巴细胞的再循环。但K细胞的杀伤作用在肿瘤免疫、抗病毒免疫、抗寄生虫免疫、移植排斥反应及一些自身免疫性疾病中均有重要作用，产生的免疫应答有免疫防护及免疫病理两种类型。NK细胞是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞。NK细胞数量较少，在外周血中约占淋巴细胞总数的15%，在脾内约有3%4%，也可出现在肺脏、肝脏和肠粘膜，但在胸腺、淋巴结和胸导管中罕见。NK细胞较大，含有胞浆颗粒，故称大颗粒淋巴细胞。NK细胞可非特异直接杀伤靶细