2、RT-PCR核酸检测篇-1-RT PCR_第1页
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文档简介

编号：2-1 主题：RT-PCR 概述： RT- PCR （Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction） 即逆转录 PCR， 是将 RNA 的逆转录（RT）和 cDNA 的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技 术。RT-PCR 技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞/组织中基因表达水平， 细胞中 RNA 病毒的含量和直接克隆特定基因的 cDNA 序列等。 目的：检测目的基因的转录产物 mRNA 的水平 原理： 提取组织或细胞中的总 RNA，以其中的 mRNA 作为模板，采用 Oligo(dT)或随 机引物利用逆转录酶反转录成 cDNA。再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，从而 获得目的基因或检测基因的表达。 步骤： 1. 总 RNA 的提取（以细胞为例） 1.1 弃去培液，PBS 洗 2 遍，加入 1ml Trizol，轻轻吹打，直至细胞脱落，吸入 1.5 ml EP 管内，静置 5 min。 （Trizol 量根据细胞密度可适当调整，建议：6 孔 板细胞长满1ml Trizol） 1.2 加入 200l 氯仿 （三氯甲烷） ， 用手剧烈震荡 15 秒， 室温静置 2-3 分钟。 （氯 仿量为 1/5 Trizol） 1.3 12000g，4，离心 15min。 1.4 仔细转移上层水相到 1 个新 EP 管中，不能贪多，约 400-500l。 1.5 加等体积异丙醇，轻柔混合 45 次，室温放置 10 分钟。 1.6 12000g，4，离心 10min。 1.7 轻轻倒去上清，用 20 l 枪轻轻吸去残液，沉淀用 1ml 75%乙醇（0.75ml 无水乙醇0.25ml DEPC 水，现配）洗 12 次，涡旋混匀。 1.8 吸去上清，5-10 分钟空气干燥 RNA。 （肉眼不能明显看到水分即可） 1.9 加 15-20l DEPC 水，吹打数次，测浓度。 注释：mRNA 不稳定，很容易讲解，因此 mRNA 提取过程中要尽量避免 RNA 酶污染。 2. RT： （参照商品化试剂盒说明书） 3. PCR： （参照商品化试剂盒说明书） 4. 电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电
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