分子生物学重点

复制1.原核生物DNA复制过程。（以大肠杆菌为例）n 双链的解开n RNA引物的合成n DNA链的延伸n 切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段1、双链的解开- ftju制有特定的起始位点，叫做复制原点。 ori(或o）、富含A、T的区段。从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子复制时，解链酶等先将DNA的一段双链解开，形成复制点，这个复制点的形状象一个叉子，故称为复制叉双链解开、复制起始大约20个DnaA蛋白在ATP的作用下与oriC处的4个9bp保守序列相结合在HU蛋白和ATP的共同作用下,Dna复制起始复合物使3个13bp直接重复序列变性,形成开链解链酶六体分别与单链DNA相结合(需DnaC帮助),进一步解开DNA双链2、RNA引物的合成DnaB蛋白活化引物合成酶，引发RNA引物的合成。引物长度约为几个至10个核苷酸，3、DNA链的延伸DNA的半不连续复制（semi-discontinuous replication)：DNA复制时其中一条子链的合成是连续的，而另一条子链的合成是不连续的，故称半不连续复制。在DNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链为前导链；合成方向与复制叉移动的方向相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一条完整的DNA链为滞后链。 在DNA复制过程中，前导链能连续合成，而滞后链只能是断续的合成53 的多个短片段，这些不连续的小片段称为冈崎片段。4、切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段（复制终止）当复制叉遇到约22个碱基的重复性终止子序列（Ter）时，Ter-Tus蛋白复合物能使DnaB不再将DNA解链，阻挡复制叉继续前移。在DNA聚合酶催化下切除RNA引物；留下的空隙由DNA聚合酶催化合成一段DNA填补上；在DNA连接酶作用下，连接相邻的DNA链2.重组的类型。第一种，减数第一次分裂的前期，同源染色体的非姐妹染色单体交叉互换；第二种，减数第一次分裂的后期，随着等位基因的分离，非同源染色体上的等位基因的自由组合。第三种，基因工程中，人们将目的基因加到运载体上再导入受体细胞，这也属于基因重组。3.修复的类型。DNA修复系统功能错配修复恢复错配碱基切除修复切除突变的碱基核甘酸切除修复修复被破坏的DNADNA直接修复SOS系统修复嘧啶二体或甲基化DNADNA的修复，导致变异1、错配修复 （mismatch repair）Dam甲基化酶使母链位于5GATC序列中腺甘酸甲基化甲基化紧随在DNA复制之后进行（几秒种后至几分钟内）根据复制叉上DNA甲基化程度，切除尚未甲基化的子链上的错配碱基2、碱基切除修复 excision repair 所有细胞中都带有不同类型、能识别受损核苷酸位点的糖苷水解酶，它能特意切除受损核苷酸上的N-糖苷键，在DNA链上形成去嘌呤或去嘧啶位点，统称为AP位点。一些碱基在自发或诱变下会发生脱酰胺，然后改变配对性质，造成氨基转换突变* 腺嘌呤变为次黄嘌呤与胞嘧啶配对* 鸟嘌呤变为黄嘌呤与胞嘧啶配对* 胞嘧啶变为尿嘧啶与腺嘌呤配对3、核苷酸切除修复1）通过特异的核酸内切酶识别损伤部位2）由酶的复合物在损伤的两边切除几个核苷酸3） DNA 聚合酶以母链为模板复制合成新子链4）DNA连接酶将切口补平4 、DNA的直接修复在DNA光解酶的作用下将环丁烷胸腺嘧啶二体和6-4光化物还原成为单体甲基转移酶使O6-甲基鸟嘌呤脱甲基生成鸟嘌呤，防止G-T配对SOS反应 (SOS response)：是细胞DNA受到损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下，细胞为求生存而产生的 一种应急措施。包括诱导DNA损伤修复、诱变效应、细胞分裂的抑制以及溶原性细菌释放噬菌体等。细胞癌变也与SOS反应有关。两个作用（1）DNA的修复；（2）产生变异4.转座作用的遗传学效应 （1）转座引起插入突变（2）转座产生新的基因（3）转座产生的染色体畸变（4）转座引起的 生物进化反转录转座子（retrotransposon）：指通过RNA为中介，反转录成DNA后进行转座的可动元件。5. 真核末端复制问题。端粒是染色体末端的DNA重复序列，作用是保持染色体的完整性。细胞分裂一次，由于DNA复制时的方向必须从5方向到3方向，DNA每次复制端粒就缩短一点（参见冈崎片段）。一旦端粒消耗殆尽，染色体则易于突变而导致动脉硬化和某些癌症。6. 染色体的结构层次。染色体的主要化学成份是脱氧核糖核酸（DNA）和蛋白质构成，染色体上的蛋白质有两类：一类是低分子量的碱性蛋白即组蛋白，另一类是酸性蛋白质，即非组蛋白蛋白质。非组蛋白蛋白质的种类和含量不十分恒定，而组蛋白的种类和含量都很恒定，其含量大致与DNA相等。结构单位是核小体，它是染色体结构的最基本单位。核小体的核心是由4种组蛋白（H2A、H2B、H3和H4）各两个分子构成的扁球状8聚体。现在我们知道，DNA分子具有典型的双螺旋结构，一个DNA分子就像是一条长长的双螺旋的纤丝。一条染色体有一个DNA分子。DNA双螺旋依次在每个组蛋白8聚体分子的表面盘绕约1.75圈，其长度相当于140个碱基对。组蛋白8聚体与其表面上盘绕的DNA分子共同构成核小体。在相邻的两个核小体之间，有长约5060个碱基对的DNA连接线。在相邻的连接线之间结合着一个第5种组蛋白（H1）的分子。密集成串的核小体形成了核质中的100埃左右的纤维，这就是染色体的“一级结构”，就像成串的珠子一样，DNA为绳，组蛋白为珠，被称作染色体的“绳珠模型”如图在这里，DNA分子大约被压缩了7倍。染色体的一级结构经螺旋化形成中空的线状体，称为螺线体或核丝或螺线筒或螺旋管，这是染色体的“二级结构”，其外径约300埃，内径100埃，相邻螺旋间距为110埃。螺旋体的每一周螺旋包括6个核小体，因此DNA的长度在这个等级上又被再压缩了6倍。300埃左右的螺线体（二级结构）再进一步螺旋化，形成直径为0.4微米（m）的筒状体，称为超螺旋管。这就是染色体的“三级结构”。到这里，DNA又再被压缩了40倍。超螺旋体进一步折叠盘绕后，形成染色单体染色体的“四级结构”。两条染色单体组成一条染色体。到这里，DNA的长度又再被压缩了5倍。从染色体的一级结构到四级结构，DNA分子一共被压缩了76405=8400倍。7.DNA的半保留复制（semi-nservative replication）：由亲代DNA生成子代DNA时，每个新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式称半保留复制。8.DNA的半不连续复制（semi-discontinuous replication)：DNA复制时其中一条子链的合成是连续的，而另一条子链的合成是不连续的，故称半不连续复制。9.冈崎片段：在DNA复制过程中，前导链能连续合成，而滞后链只能是断续的合成53 的多个短片段，这些不连续的小片段称为冈崎片段。10.端粒酶（Telomerase），在细胞中负责端粒的延长的一种酶，是基本的核蛋白逆转录酶，可将端粒DNA加至真核细胞染色体末端。11.Klenow片段，又名DNA聚合酶I大片段（克列诺片段，Klenow fragment，或称克列诺酶，Klenow enzyme）：E.coli DNA聚合酶经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端605个氨基酸残基片段。该片段保留了DNA聚合酶I的5-3聚合酶和3-5外切酶活性，但缺少完整酶的5-3外切酶活性。DNA聚合酶 I（DNA-pol I）断开后的存在另一个323个氨基酸残基片段，保留5-3外切酶活性。12.复制子：是DNA复制是从一个DNA复制起点开始，最终由这个起点起始的复制叉完成的片段。DNA 中发生复制的独立单位称为复制子。每个复制子使用一次，并且在每个细胞周期中只有一次。复制子中含有复制需要的控制元件。在复制的起始位点具有原点，在复制的终止位点具有终点。13.复制叉：是DNA复制时在DNA链上通过解旋、解链和SSB蛋白的结合等过程形成的Y字型结构称为复制叉。转录1. 原核转录过程原核生物的转录过程可分为起始、延伸、终止三个部分。起始：RNA聚合酶结合到双链DNA的启动子序列上，引起DNA局部解旋。RNA合成无需引物，因子释放，形成一个负责RNA链延伸的三元复合物。延伸：RNA聚合酶沿着DNA链移动，DNA链上始终保持一段转录泡的解旋区，聚合酶在转录泡的前方解旋DNA，在其后复旋DNA. 终止：RNA聚合酶识别终止子，导致不再有新的核苷酸插入，该序列通常为发夹结构，。一些终止子需要一种称作的辅助因子来终止转录2.真核生物的转录起始过程真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化，转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。（1）. 转录起始前的上游区段 顺式作用元件(cis-acting element)：影响自身基因表达活性的非编码DNA序列。 例： 启动子、增强子、弱化子等 增强子：在启动区存在的能增强或促进转录的起始的DNA序列。但不是启动子的一部分。特点：1.远距离效应；2.无方向性；3.顺式调节；4.无物种和基因的特异性；5.具有组织特异性；6.有相位性；7.有的增强子可以对外部信号产生反应。（2）. 转录因子：能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式作用因子(trans-acting factors)。 反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为转录因子(transcriptional factors, TF)。 参与RNA-pol转录的TF -TFD、 TFA、TFB、TFF、TFE、TFH（3）转录起始前复合物(pre-initiation complex, PIC) 真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。 （4）模板理论(piecing theory) 一个真核生物基因的转录需要3至5个转录因子。转录因子之间互相结合，生成有活性、有专一性的复合物，再与RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。3. 增强子作用及其特点增强子：在启动区存在的能增强或促进转录的起始的DNA序列。但不是启动子的一部分。特点：特点：1.远距离效应；2.无方向性；3.顺式调节；4.无物种和基因的特异性；5.具有组织特异性；6.有相位性；7.有的增强子可以对外部信号产生反应。增强子作用特点:1增强子提高同一条DNA链上基因转录效率，可以远距离作用，在基因上游或下游都能起作用 2.增强子作用与序列的正反方向无关。3.增强子与启动子在结构、功能上密切联系。4、增强子必须与特定的蛋白质结合后才能发挥增强转录的作用。增强子一般具有组织或细胞特异性，是由这些细胞或组织中具有的特异性蛋白质因子所决定的。4.启动子及其结构启动子定义：与RNA聚合酶结合的位于转录序列上游的特异起始位点。启动子包含DNA聚合酶特异结合和转录精确特异起始必须的保守序列，启动子大约延续5010bp距离。启动子的基本结构：转录单元：转录单元（transcription unit) 是一段从启动子开始至终止子（terminator）结束的DNA序列，RNA聚合酶从转录起点开始沿着模板前进，直到终止子为止，转录出一条RNA链。在细胞中，一个转录单元可以是一个基因，也可以是几个基因。转录起点：转录起点是指与新生RNA链第一个核苷酸相对应DNA链上的碱基，研究证实通常为一个嘌呤。常把起点前面，即5末端的序列称为上游（upstream），而把其后而即3未端的序列称为下游（downstream）。启动子区：启动子区是RNA聚合酶的结合区，其结构直接关系到转录的效率。-10位区和-35位区-10序列=Pribnow盒-10序列是几乎存在于所有启动子中的位于起始位点上游第10bp处的保守6bp的区域(TATAAT)。-10序列负责转录精确特异的起始.-35序列=Sextama盒在大多数公认的启动子中，-35是位于起始位点上游第5bp处的保守6bp的区域（TTGACA）。5. 基因的一般结构人类结构基因4个区域：编码区，包括外显子与内含子；前导区，位于编码区上游，相当于RNA5末端非编码区（非翻译区）；尾部区，位于RNA3编码区下游，相当于末端非编码区（非翻译区）；调控区，包括启动子和增强子等。基因编码区的两侧也称为侧翼顺序6. 增强子概念增强子是来自上游或下游数个kb的能显著活化转录的多种序列元件7.转录元件（顺式作用元件）8.转录因子：转录因子(transcription factor)是一群能与基因5端上游特定序列专一性结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。转录因子包括通用转录因子（GTF）和特殊转录因子（STF）9.羧基末端结构域（CTD）：指位于RNAP最大亚基的羧基末端的7肽，即酪-丝-脯-苏-丝-脯-丝 串联重复。10.Stem-loop 茎环结构 11.Promoter 启动子 12.Enhancer 增强子13.编码链与模板链的区别DNA分子两条链中只有一条具有转录功能,这条具有转录功能的链叫做模板链或反义链,另一条无转录功能的链叫做编码链或有义链。应该指出,在一条包含有若干基因的DNA分子中,各个基因的有义链,并不都在同一链上,也就是说,它们各自具有自己的有义链,即有的基因的有义链是35单链；有的基因的有义链则是53单链。所以,也可以说,DNA双链中的一条链对某些基因来说是有义链,而对另一些基因来说,则是反义链。14.不对称转录：即通常在转录单位的2条DNA链中仅有一条链适合转录成RNA，与以U代替T的转录的RNA链序列一致的那条DNA链为正链、编码链或有意义链。另外一条DNA链被称为负链、模板链或反意义链。转录后加工1.mRNA的前体是什么？Pre-mRNA即“nnRNA（核内不均一RNA）”2.mRNA前体加工的四个方面？（1）5-加帽：mRNA前体的5末端被修改成5帽子结构；（2）3-切割和多聚腺苷酸化：大多数mRNA前体被在近3末端切割，并添加多聚腺苷酸尾（3）内含子剪接：内含子序列通过剪接被除去，即切割外显子-内含子分界线，并把外显子序列末端连接在一起；（4）甲基化：有些核苷酸通过甲基化被修饰3.RNA加工的概念是什么？在细胞内，由RNA聚合酶合成的原初转录物往往需要经过一系列的变化，包括链的裂解、5端与3端的切除、末端特殊结构的形成、核苷的修饰和糖苷键的改变以及剪接和编辑等信息加工过程，始能转变为成熟的RNA分子，此过程称之为RNA的成熟，或称为转录后加工。4.RNA编辑是某些RNA，特别是mRNA的一种加工方式，它导致DNA所编码的遗传信息的改变，因为经过编辑的mRNA序列发生了不同于模板DNA的变化。5.断裂基因（外显子E，con，Intron）真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因。6.内含子的结构特征是什么？内含子以gu开始，以ag结束，其内部有一个保守的支化点序列和一个多聚嘧啶区7.RNAP是什么？ RNAP是什么？RNAP是RNA聚合酶、 RNAP是RNA聚合酶8.PolyA是什么？多聚腺苷酸9.选择性加工的类型是什么？（也就是mRNA加工的类型）（1）选择不同的启动子（2）选择不同的多聚腺苷酸位点（3）选择不同的外显子（4）保留不同的内含子翻译1、蛋白质合成的延长过程是哪五个阶段？答：氨基酸的活化、翻译的起始、肽链的延伸、肽链的终止、蛋白质前体的加工(一)氨基酸的活化原核生物中，起始氨基酸是：甲酰甲硫氨酸，起始AA-tRNA是：fMet-tRNAfMet，真核生物中，起始氨基酸是：甲硫氨酸，起始AA-tRNA是：Met-tRNAMet(二)翻译的起始，原核生物（细菌）为例：翻译起始因子：IF-1、IF-2、IF-3、翻译起始又可被分成3步：1. 核蛋白体大小亚基分离2、30S小亚基通过SD序列与mRNA模板相结合。3.在IF-2和GTP的帮助下， fMet-tRNAfMet进入小亚基的P位，tRNA上的反密码子与mRNA上的起始密码子配对。4、带有tRNA、mRNA和3个翻译起始因子的小亚基复合物与50S大亚基结合，GTP水解，释放翻译起始因子。真核生物翻译起始的特点核糖体较大,为80；起始因子比较多； mRNA 5端具有帽子结构 Met-tRNAMet mRNA的5端帽子结构和3端polyA都参与形成翻译起始复合物； 真核生物翻译起始复合物形成原核生物中30S小亚基首先与mRNA模板相结合，再与fMet-tRNAfMet结合，最后与50S大亚基结合。而在真核生物中，40S小亚基首先与Met-tRNAMet相结合，再与模板mRNA结合，最后与60S大亚基结合生成80SmRNAMet-tRNAMet起始复合物。(三)肽链的延伸肽链延伸由许多循环组成，每加一个氨基酸就是一个循环，每个循环包括：AA-tRNA与核糖体结合、肽键的生成和移位。延伸因子： 原核生物：EF-T (EF-Tu, EF-Ts)、 EF-G真核生物：EF-1 、EF-2 1、AA-tRNA与核糖体A位点的结合需要消耗GTP，并需EF-Tu、EF-Ts两种延伸因子2、肽键形成：是由转肽酶/肽基转移酶催化3、移位：核糖体向mRNA3端方向移动一个密码子。需要消耗GTP，并需EF-G延伸因子A位点是新到来的氨酰-tRNA的结合位点。P位点是肽酰- tRNA的结合位点。E位点是延伸过程中释放tRNA的位点，即，去氨酰-tRNA通过E位点脱出，释放到核糖体外的胞质中。（四）肽链的终止 RF1：识别终止密码子UAA和UAG 终止因子， RF2：识别终止密码子UAA和UGA ，RF3：具GTP酶活性，刺激RF1和RF2活性，协助肽链的释放，真核生物只有一个终止因子（eRF）(五)蛋白质前体的加工（1）、N端fMet或Met的切除（2）、二硫键的形成（3）、特定氨基酸的修饰，磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羟基化和羧基化（4）、切除新生肽链中非功能片段2、 翻译包括哪五个阶段？答：氨基酸活化、氨酰TRNA、多肽链合成的起始、延长、终止、翻译后加工3、 遗传密码的特性？答：1.方向性：密码子的阅读方向是5到3端。2.简并性：除蛋氨酸和色氨酸只有一个密码子外，其它氨基酸都有好几组密码子。3.通用性：无论是病毒还是原核生物、真核生物，都共同使用一套密码字典，但有例外。4.连续性：在mRNA上，从起始密码子到终止密码子，密码子的排列是连续的，既没有重叠也没有间隔。5.有起始密码子和终止密码子。6.变偶性：密码的简并性只涉及第三位碱基，即同一个氨基酸的不同密码子中，前两个碱基均相同，第三个不同。4、 蛋白质靶向定位？答：指蛋白质合成后，经过复杂机制，定向输送到其最终发挥生物学功能的目标地点5、 信号肽：是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短（长度5-30个氨基酸）肽链。常指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移（定位）的N-末端的氨基酸序列（有时不一定在N端）6、 分子伴侣：细胞核内能与组蛋白结合并能介导核小体有序组装的核质素称为分子伴侣7、 真核在翻译时头尾形成的环形结构？答8、 Shine-dalgaron sequence（SD序列）：mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。SD序列在细菌mRNA起始密码子AUG上游10个碱基左右处，有一段富含嘌呤的碱基序列，能与细菌16SrRNA3端识别，帮助从起始AUG处开始翻译。9、 IRES（内部核糖体介入位点，无帽子结构的RNA）：一般真核mRNA的翻译都需要5帽子来介导核糖体结合，但真核生物和病毒中还存在一些例外情况，例如一些基因5端具有一段较短的RNA序列（约150-250BP），这类RNA序列能折叠成类似于起始tRNA的结构，从而介导核糖体与RNA结合，起始蛋白质翻译，这段非翻译RNA被称为内部核糖体进入位点序列10、 5-UTR,3UTR(非翻译区）：非翻译区（UTR，untranslated region）在分子遗传学中，是指任意一个位于mRNA链编码序列两端的片段。如果其位于5端，则称为5非翻译区（或“前导序列”）, 反之若位于3端，则称为3非翻译区（或“尾随序列”）11、 起始密码：mRNA上的碱基顺序每3个碱基用解读框架划分开，可决定其所生成蛋白质的氨基酸顺序，为了使碱基顺序作为遗传信息能正确转译，通常需要从某个特定的位置开始转译12、 终止密码：蛋白质翻译过程中终止肽链合成的信使核糖核酸(mRNA)的三联体碱基序列。mRNA翻译过程中，起蛋白质合成终止信号作用的密码子。mRNA分子中终止蛋白质合成的密码子13、 多核糖体：把细胞放在极其温和的条件下处理，就能得到几个到几十个核糖体在一条mRNA上结合起来的形态。这称为多核糖体基因调控一、乳糖操纵子的调控正调控：阻遏蛋白与操纵基因结合，则组织结构基因的转录。负调控：活化蛋白结合DNA则提高转录速度。调节类型不与DNA结合与DNA结合负调控 阻遏蛋白操纵子开启操纵子关闭正调控 CRP/CAP操纵子关闭操纵子开启CRP：cAMP受体蛋白既环腺苷酸受体蛋白 CAP：降解物基因活化蛋白阻遏蛋白对乳糖操纵子的负调节前提条件阻遏蛋白结合操纵基因阻遏蛋白活性操纵子开或关乳糖缺乏能有活性操纵子关闭乳糖丰富不能无活性操纵子开启CRP/CAP对乳糖操纵子的正调控前提条件cAMP水平CRP-cAMPCRP-cAMP和RNAP结合启动子转录水平葡萄糖缺乏cAMP高形成结合很高葡萄糖存在cAMP低否否微弱1、 色氨酸操纵子的弱化或衰减阻遏作用决定转录是否起始，而衰减作用决定转录是否继续下去。色氨酸操纵子的衰减作用前提条件核糖体的定位前导RNA选择的发卡结构抗终止或终止结构转录Trp缺乏=trp-tRNA缺乏停在色氨酸密码子2:3阻塞1区抗终止子继续转录Trp丰富=trp-tRNA丰富经过1区或连续到肽的末端3:4阻塞1和2区不依赖的终止子停止转录2、 参与调控的RNA的种类反义RNA 编码RNA 干扰RNA3、 RNAi：干涉RNARNAi是能够沉默与其匹配基因的表达的dsRNA小片段。RNAi在体内的作用包括：（1）调节基因