4 2天然产物分离技术VIP

1,4.3天然产物分离技术,4.3.1前言,重要性天然药物的开发（WTO，知识产权）提取基础分离,2,提取,单体分离,3,4.3.2提取方法,(1)天然活性成分提取方法溶剂法水蒸气蒸馏法升华法压榨法吸收法等,4,(2)提取溶剂a水（鞣质、糖类、蛋白质）HClNaOH成盐溶出冷水、热水b醇（乙醇、甲醇）95%-alkaloids,60-70%-皂苷、黄酮苷40-50%-强心苷c丙酮、乙酸乙酯、苯等（苷元）,5,(3)溶剂提取方法a冷浸法（3-4次）优缺点b渗漉法（10倍量）受热易分解物溶剂梯度c煎煮法（3-4次）水或稀醇,6,4.3.3分离分类a粗分（部位分离）（萃取、大孔树脂）b细分（部位分组分离）c单离（单体成分分离）方法层析（平面层析、柱层析、逆流层析）SFE(超临界萃取)结晶,7,4.3.3.1平面层析,(1)TLC定性：预试对照标准品种类：硅胶G，硅胶F254，反向硅胶，聚酰胺、Al2O3等。显色：广泛碘、H2SO4EtOH专属alkaloids,flavonoids等,8,薄层层析硅胶板,硅胶,9,PTLC（PreparativeTLC）制备量mg-g级a吸附剂（adsorbents）材料：Silicagel尺寸：20202040厚度：0.5-2mmb样品带手工自动点样器,10,c流动相选择三角性法则d样品的收集洗脱显色：定位转移洗脱,11,ePTLC制备样品时引入的杂质粘合剂杂质指示剂Other(分解物)(Al2O3作吸附剂)难点解决办法：SephedexLH-20,12,f技术发展HPTLC巨形板TLC不锈钢板(6060)厚度5mm上样量10g带浓缩带TLC展开方式多次展开（同方向）双向展开移植TLC,13,(2)OPLC（OverpressureLayerChromatography）又称OverpressureTLC(OPTLC)1979年Tyihak综合TLC,HPTLC优点，吸收HPLC的某些特点。平面细颗粒蒸汽相恒流速,14,特点a与传统PTLC比较b效率50mg0.5g1hc优点制备型OPLC联机检测分段收集应用氨基酸，多肽，胡萝卜素，生物碱等,15,4.3.3.2柱层析ColumnChromatogrphy,常压柱层析(0.150g)（OrdinaryColumnChromatogr.）吸附性柱色谱分配性柱色谱植物有效柱色谱离子交换柱色谱成分分离凝胶过滤柱色谱主要手段聚酰胺柱色谱大孔吸附树脂,16,(1)吸附性柱层析Al2O3orSilicagel生物碱水溶性Al2O3甾体脂溶性Silicagel挥发油脂溶性,17,a装柱Al2O3：吸附剂:样品(2050:1)Silica：吸附剂:样品(20100:1)1)干法与TLC吻合度较好，溶剂消耗少2)湿法紧密，前沿整齐,18,b上样1)湿法溶剂溶解上样（少量），低极性2)干法低极性溶剂溶解性差c洗脱常压低压梯度洗脱d收集与检查等份TLCUV,19,(2)聚酰胺（Polyamide）a原理1)氢键吸附原理酰胺键酚类、酸类、醌类、硝基化合物成氢键能力与溶剂有关水甲醇乙醇丙酮稀氨液稀NaOH氢键吸附规律：基团多少；基团位置；芳香核，共轭双键；分子内氢键,20,2)极性吸附原理非极性脂肪链萜类、甾体、生物碱、黄酮苷与苷元非水（正相）含水（反相）b聚酰胺粉层析用（80100目）,21,c操作1)装柱细粉水浸泡装柱，自然沉降2)上样2030%水溶液上样40-60:13)洗脱水含水醇95%醇3%NaOH5%NaOHd再生5%NaOH,5%HCl洗涤,22,（3）分配性柱层析a原理利用混合物在两相互不混溶中分配系数不同，而达到分离的一种柱层析方法。分配系数差异愈大，分离效果愈好。b支持剂硅胶、硅藻土、纤维粉c溶剂系统的选择PC层析选择d操作1)装柱，2)上样，3)洗脱,23,(4)凝胶柱层析（SephadexLH-20）由葡聚糖凝胶SephadexG-25交联羟丙基而制备，同时具备吸附层析、分配色谱和分子筛功能的独特层析介质，溶剂系统没有限制，包括水相缓冲液、丙酮、乙酸乙脂、氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃、甲苯和各种混合溶剂，非常适合于天然产物纯化。,24,中草药有效成分如苷类、生物碱、黄酮、蒽醌、内酯、帖类、甾类、多酚的分离效果良好。德国科学家HansHenke著有SephadexLH-20凝胶色谱分离专著，详尽叙述了SephadexLH-20在植物化学研究中的应用。,25,a原理分子筛：分子的大小和形状吸附层析：被分离化合物与凝胶间的氢键分配层析：被分离化合物在流动相（溶剂）和固定相（凝胶）之间的分配,26,b操作1)装柱洗脱剂溶胀后悬浮液搅拌装柱2)上样3)洗脱水溶性好水或电解质溶液水溶性差醇水或丙酮水极性较小丙酮、氯仿,27,4)浓缩视情况而定5)再生洗脱剂平衡有污染：0.2NNaOH-0.5NHCl浸泡水洗净-平衡保存：50%丙酮水溶液,28,应用实例SephadexLH-20层析分离川穹里的腺嘌呤，贝母里的腺苷浙贝宁、茄啶，日本附子里的乌头碱，银杏黄酮甙，夏枯草中的夏枯草黄酮苷、皂苷，升麻中的酰胺苷，水蔓菁中的水蔓菁萜苷，鹿衔草中的鹿蹄草苷，淫羊霍中的羊霍苷，芸香苷，红花中的槲皮素、芦丁、山柰酚、红色素等多种黄酮，麦冬中的麦冬黄酮，鹿蹄草中的儿茶素，紫草中的萘醌、多酚。,29,(5)离子交换柱层析a原理利用大分子树脂网状结构内存在的交换基团而进行的交换性柱层析方法。b影响离子交换的因素pH值化合物的性质化合物的浓度温度交换溶剂交换流速树脂用量,30,c树脂的选择d操作1)树脂预处理2)装柱3)上样4)交换5)洗脱6)树脂再生,31,(6)大孔吸附树脂层析a大孔吸附树脂简介大孔树脂吸附技术是20世纪七十年代发展起来的一种新工艺，是由苯乙烯、二乙烯或a-甲基丙烯酸酯等聚合而成的高分子网状孔穴结构。药液通过大孔树脂吸附，其中的有效成分吸附在树脂上，再经洗脱回收，可除掉药液中杂质，是一种纯化精制药的有效方法。,32,非极性吸附树脂在吸附药液中成分时,主要是依靠物理结构（如比表面、孔径等）起作用。其操作的基本程序：提取液通过大孔树脂吸附上有效成分的树脂洗脱洗脱液回收洗脱液干燥半成品。该技术目前已较广应用于新药的开发和生产中,主要用在分离和提纯过程中。,33,b大孔吸附树脂的优点经大孔树脂吸附技术处理后，可有效地去除水煎液中大量的糖类、无机盐、黏液质等吸潮成分，有利于多种中药剂型的生产，增强产品的稳定性。大孔树脂吸附技术还能缩短生产周期,所需设备简单。免去了静置沉淀、浓缩等耗时多的工序。,34,c大孔吸附树脂吸附机理,35,d影响分离的因素分子极性大小分子体积PH值树脂柱的清洗洗脱液的选择,36,f操作1)树脂预处理2)装柱3)上样4)洗脱5)树脂再生,37,g应用适合中等程度的水溶性化合物中药、天然色素，从发酵液中得到抗生素（青霉素先锋霉素螺旋霉素）蛋白质（胰岛素肽系抗生素）功能性食品添加剂维生素）等聚苯乙烯合成吸附树脂吸附含有电子的化合物如含有苯环和共轭双键的化合物甲基丙烯酸甲酯类吸附剂吸附含羧基、酯基、氨基、酰胺基等与H可结合的官能团的化合物,38,(7)特殊柱层析（SpecialColumnChromatogr.）干柱柱层析减压柱层析植物有效成分特殊柱层析短柱柱色析分离新方法闪式柱色析棒色谱,39,A干柱柱层析1)特点a优点分离效果比湿法装柱高可用薄层最佳分离条件直接套用对有荧光或颜色的物质，可在紫外灯下将已分离的各层带分别切开，避免常规液相层析中因流出液收集不当而造成的层带交叉适用于制备性分离设备简单，消耗溶剂少，工时省，共轭双键；分子内氢键,40,b缺点样品容量比湿法装柱小，因此，消耗填充剂量大2)原理与薄层层析相同，借颗粒间的孔隙所产生的毛细作用而展层，因此，可套用薄层条件，分离效果亦相同。干填充剂颗粒的深孔内充满空气，溶剂和样品分子很难进入颗粒的深孔，吸附与解吸主要在外部表面进行。克服了样品分子由于进出填充剂深孔所造成的扩散及传质缓慢，因此其柱效比湿装柱高。,41,a种类（填充剂）氧化铝吸附层析硅胶干柱聚酰胺层析分配层析,42,b展开剂多采用混合溶剂避免溶剂解混产生，影响分离效果。解决办法：搭配极性相差适当的溶剂如石油醚乙醚氯仿乙醇石油醚乙醇氯仿甲醇苯、苯酚等不透过紫外光的溶剂对紫外光灯检出层带有影响,43,c分离条件探索探索和选择对样品分离度最大的填充剂和展开剂薄层层析(最佳分离条件)d样品容量1:1001:300样品只能与吸附剂的外部表面接触,44,4)操作a柱的制备(常用50cm)聚乙烯薄膜柱玻璃柱b加样和展开加样：溶液加样；拌样加样展开：c层带的定位及分割,45,B减压柱层析（抽柱VacuumLiquidChromatography)1)简介简便、实用、快速的层析方法，其基本原理与吸附层析相同，适用于较大量的制备性分离或提取物的极性分段划分。（粗分）2）操作G-4垂熔玻砂漏斗或短粗柱、磨底抽滤瓶、减压泵及分部收集瓶组成。a装柱，b上样，c洗脱，d收集,46,3）注意事项a真空度2070mmHgb洗脱剂极性由小到大梯度递增c交叉色带4）应用实例二萜生物碱的分离黄酮类化合物的分离,47,C短柱柱层析短柱柱层析在制备量分离方面有独到之处，在微量成分的富集上有一定实用价值。1)短柱层析理论经典色谱理论：柱效随柱径的加大而下降，柱子愈长，分离越好，柱效越高。近来研究发现，此理论有一定局限性，在实践基础上，提出新的观点：柱径加大后，在适当条件下柱效反而提高。a适当条件：柱径：320cm短粗柱柱长：530cm,48,b原因Knox提出“无限直径效应”，认为柱短，柱径相对较粗，层析相对集中于中部进行，消除或减少了“柱壁效应”。柱短，可使洗脱液在柱内受阻减少，且截面增大，使自然流速大大增加，为采用高细度吸附剂提供了可能条件。2)层析方法同普通柱层析，不同之处在于采用短粗柱，使用吸附剂粒度细小，且粒度范围窄，装柱应尽量均匀。洗脱时多采用梯度洗脱，对洗脱剂选择较严格。,49,3)注意事项a填料、洗脱剂bRf0.2c预纯化操作,50,D闪式柱层析（FlashChromatography)20世纪70年代后发展起来的一种快速柱层析技术。1)简介柱短，分离时间短，快，分离效率高。闪式硅胶（FlashSilicagel）进口，国产（山东即墨化学试剂厂）球型微粒，粒度在40-63m(230-400目)之间（均匀）加压层析0.3-1Kg/cm210mg-10g样品10-15min,51,2)操作与普通柱层析法基本相同。a装柱：湿法干法（20cm）b上样：拌样湿法c洗脱：Rf0.2-0.3加液8-10cm，加压3)实际应用皂苷、甾体、生物碱、黄酮,52,E棒色谱（StickChromatography)1)简介与制备型薄层层析原理相同,分离量大。把硅胶、氧化铝等制成园柱形的棒，下端上样，上行展开而达到分离目的。2)操作a制棒b上样,53,c展开引导座两端相通，内填层析硅胶展开装置层析槽，密封罩d收集3)应用生物碱、皂苷、甾醇等,54,F加压柱层析（PressureLiquidChromatogr.）类型低压柱层析加压柱层析中压柱色析高压柱色析优点分离因子a高，故能完成复杂的分离过程a=两组分的相对保留时间之比分离因子是评价色谱柱选择性的一种指标,55,制备型与分析型的区别：分析型：不要求样品回收制备型：要求样品载量高，因此便要求有特殊的层析装置和操作系统基本原理1)加压柱层析效果的好坏Speed分析型制备型ResolutionLoad与Load相关的因素柱径柱长粒度填充剂密度,56,2)加压柱层析目的得出一个化合物Lab.一定纯度生产规模回收率单位时间内分得的化合物量洗脱液流速快可用更细的颗粒，分辨率提高避免不稳定化合物在开口柱上由于长时间暴露而导致分解（最大优点）,57,3)分类（Classifcaton）AnalyticalHPLC:ug-5mgPrep.HPLC:5mg-gmsLow-pressureLC:10mg-1gMedium-pressureLC:100mg-100g选择制备型系统要考虑的事以上各法的极限（适应范围）要分离的样品量根据以上条件要求而选用的方法柱大小，固定相，压力，洗脱剂经验积累,58,4)操作aTLC探索条件（层析系统选择）b分析型小试c优化条件（超载）d套用优化条件（制备）e正式操作f获得纯品g分析鉴定纯品h再生柱正相：actonewatermethanolTHF-dichloromethane反相：water-methanol,59,5)Prep.LC的各种条件的应用情况及优化aColumn:loading,f,size,columnefficiency,a,Knumberoftheoreticalplates,resolutionbStationaryphase:液液,固液,粒度大小硅胶-普通,键合相AgNO3coatedsilicagel-涂层AgNO3分离萜类分开不同双键数目或位置Paired-ionChromatogr.-生物碱在柱上增加一种离子,该离子与欲分离物相反,从而成为离子对,而成中性,易分离Chiralstationaryphasec装柱技术,60,d加样法（Sampleintroduction）e加压泵（Pump）f检测器（Detectors）g流动相（Eluent）h分离样品收集i切割与再循环技术二个成分色带太近，超出层析灵敏度范围，分不开时，采取的方法。（样品通过检测器不受破坏）j柱超载及中心切割法要想得量多，需超载，要用中心切割法纯化注意检测器峰值,61,G低压柱层析（Low-pressureLC）1)简介低压柱层析可以用玻璃自制，现绝大多数是购买预制柱。长度：从240mm440mm内径：从10mm37mm外径：从13mm42mmLIDOD进样量A24010130.3-1ml0.2gB31025281-5ml1gC44037422-10ml3g,62,2)操作a填充剂40-60m与TLC相同，流速快b加压氮气瓶约5bar机械泵c展开d收集,63,H中压柱层析（Medium-pressureLC）,64,紫杉又称红豆杉，为红豆杉科红豆杉属（Taxus）植物，红豆杉属共有11个种，我国有4种和1个变种。20世纪70年代初，Wani等首先从短叶红豆杉(Taxusbrevifolia)中分离得到紫杉醇（Taxol）,实例紫杉醇的色谱分离,国家一级保护野生植物，全球十大濒危物种之一,65,红豆杉生长缓慢分布有限Taxol含量低树皮中Taxol含量:0.00001-0.069%3000棵树=10吨树皮=1kgTaxol=500病人,66,