发酵工程第十二章微生物细胞破碎原理与技术

第十二章微生物细胞破碎原理与技术,微生物细胞破碎原理与技术,第一节细胞壁的组成和结构第二节细胞破碎的方法和破碎率的测定,第二节细胞破碎的方法和破碎率的测定,细胞壁的破碎细胞破碎的方法破碎率的测定破碎技术的研究方向,一、细胞壁的破碎,细胞破碎的方法如何进行选择，取决于破碎的目的和待破碎的生物体类型。生物体对破碎的敏感度细胞壁破碎的影响因素,细胞对破碎的敏感度,细胞壁破碎的影响因素,主要阻力：连接细胞壁网状结构的共价键；破碎根据细胞的种类不同进行区分：细菌、酵母菌、霉菌等。机械搅拌：细胞形状、大小、细胞壁厚度及交联度等。化学溶解：细胞壁组成非常重要，其次是结构。,细胞破碎的方法和破碎率的测定,细胞壁的破碎细胞破碎的方法破碎率的测定破碎技术的研究方向,二、细胞破碎的方法,细胞破碎方法选择的注意事项细胞破碎方法,1、细胞破碎方法选择的注意事项,细胞的数量；所需要产物对破碎条件的（温度、试剂、酶）的敏感性；要达到的破碎程度和破碎必须的速度；尽可能采用最温和的方法；具有大规模应用潜力的生化产品应选择适合于放大的破碎技术。,2、细胞破碎方法,固体剪切法液体剪切法超声破碎法酶溶法化学渗透法其他方法,、固体剪切法,概念工作原理表示方法破碎效果的影响因素,概念,固体剪切法：也叫珠磨法（beadmill），将细胞在珠磨机中破碎。珠磨机种类较多，如高速组织捣碎机和匀浆机、高速珠磨机及砂磨机等等。卧式珠磨机比立式珠磨机效果要好。,工作原理,珠磨法工作原理：进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂混合一起快速搅拌或研磨，他们之间的互相剪切、碰撞使细胞破碎，释放出内含物。珠液分离器的切断下，珠子被滞留而浆液流出。,破碎程度的表示方法,用破碎率（Z）表示。用单位细胞释放出的内含物（R）表示,破碎率（Z）,1,2,间歇操作和连续操作的表示方法有一定区别，即由破碎时间变成平均停留时间。,K为反应常数，与珠体直径、装量、细胞浓度等有关系，可以直接影响破碎程度和需要的能量。,破碎率的确定需要依据总产物的总收率来确定，而且要兼顾下游过程。,单位细胞释放的内含物（R）,释放蛋白质数量的随时间变化的规律。,连续操作过程中，要考虑返混的程度，n为连续研磨罐的数目。,破碎效果的影响因素,转盘外缘速度细胞浓度c珠粒大小温度流量,a、转盘外缘速度,由转盘产生的碰撞频率和剪切强度与它的边缘线速度有关，在一定范围内，破碎的比速度与这个外缘线速度成正比。随线速度增加，会提高产生的热量和消耗过多功率。对于给定的处理量和对蛋白质的释放率的要求，存在最佳效率点；另外，必须限制最高线速度，保证产物活性。,b、细胞浓度,最佳破碎的细胞浓度应该用实验来确定。产生热量随细胞浓度降低而下降，但单位质量细胞所消耗的功率却增加。理论与实际观察现象有出入。,c、珠粒大小,磨珠大小和填量的影响：磨珠越小细胞破碎速率则越快，但磨珠越小，越容易出现细胞漂浮、难以保留在研磨机内。磨珠大小与需要提取的酶在细胞中的位置有关。一定范围内磨珠填量越大细胞破碎速率越快。,d、温度,研究表明温度5-40范围内对破碎物影响较小。研磨过程中温度会上升。,e、流量,提高通过单一反应器的料液流量即单位时间的处理量，会使破碎量下降（一级反应）。通常情况下，破碎不是一级反应，影响因素较多。故通过流量控制不能完全达到效果。,、液体剪切法,概念和工作原理动力学方程破碎率（效果）的影响因素优缺点,概念和工作原理,利用高压使细胞悬浮液通过针型阀，由于突然减压和高速冲击撞击环，使细胞破碎。细胞在一系列高速运动中经历了剪切、撞击和由高压到常压的改变，造成细胞破碎。操作的条件根据菌体种类、浓度和酶的位置而定。,不同细胞破碎率,动力学方程,液体剪切法破碎动力学的两个表示方法。,破碎率（效果）的影响因素,影响破碎效果的主要因素是：压力、温度和通过匀浆器的次数。压力：增大压力可以提高破碎率，但是也有一个阈值，常用为55-70MPa；温度：破碎率随温度升高而增加，但是温度过高会影响产物，只适宜非热变性产物。通过匀浆器的次数：通过次数越多，破碎效果越好。细胞壁：细胞壁结构和网状交联情况决定了破碎效果。,液体与固体剪切法比较,、超声破碎法,概念和工作原理动力学方程破碎率的影响因素,概念和工作原理,超声波破碎法：采用超声波破碎机在15-25kHz的频率下使悬浮液中微生物细胞失活，在较高输入功率下操作，可破碎细胞。机理：可能与超声波引起的空穴现象引起的冲击波和剪切作用有关。,动力学方程,超声波细胞破碎中蛋白质释放动力学遵循一级反应定律。,破碎率的影响因素,振幅：与声能有关、影响蛋白质释放速率常数；细胞悬浮液黏度：黏度影响能耗并抑制空穴现象；表面张力：添加表面活性剂或从细胞释放表面活性物质能显著影响声波破碎效果；被处理的悬浮液体积：体积越大需要越大的声能引起强烈的涡流和大气泡；珠粒的体积和直径：添加细小的玻璃或钢珠，可提高破碎效率；探头的形状和材质：探头可以影响声能的效率；细胞悬浮液的流速：连续操作中流速和停留时间会影响总收率。,、酶溶法,酶溶法的分类酶溶法的优点酶溶法的缺点,酶溶法的分类,外加酶法：外加的溶酶同样具有高度专一性，故一般需要选择适宜的酶和酶反应体系；自溶法：利用本身产生的溶胞酶将微生物细胞本身降解。通过控制条件，可以诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身的溶胞酶活性，达到细胞自溶的效果。可以采用加热法或干燥法。,酶溶法的优点,产品释放的选择性高；抽提的速率和收率高；产品的破坏最少；对pH和温度等外界条件要求最低；不残留细胞碎片。,酶溶法的缺点,溶酶价格高，限制了大规模应用；酶溶法通用性差；存在产物抑制。,、化学渗透法,概念和原理化学渗透法优缺点化学渗透法常用试剂,概念和原理,化学渗透法：利用某些化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞中某些组分的方法。化学渗透法的工作原理取决于不同化学试剂，不同试剂作用性质不一样。,化学渗透法优缺点,优点：对产物释放具有一定选择性；细胞外形保持完整，碎片小、粘度低易于分离和进一步提取；缺点：通用性差；作用时间长，效率低；有些试剂有毒。,化学渗透法常用试剂,酸碱：通过调节溶液pH，改变细胞所处环境，使发酵液中物质之间作用力改变；有机溶剂：分解细胞壁中的类脂，导致细胞溶胀破裂；表面活性剂：促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞破碎；EDTA螯合剂：用于处理革兰氏阴性菌，对细胞外层膜有破坏作用；变性剂：破坏氢键，降低胞内产物之间相互作用，使之容易释放。,、其他方法,除上述方法之外，还有X-press法、渗透压法、反复冻结-融化法、干燥法等。但是这些方法不适用于大规模细胞破碎的需求。,细胞破碎的方法和破碎率的测定,细胞壁的破碎细胞破碎的方法破碎率的测定破碎技术的研究方向,三、破碎率的测定,直接测定法：利用适当方法，计数破碎前后的细胞数量，可以计算出破碎率；目的产物测定：细胞破碎后，通过测定破碎液中目的产物的释放量来估算破碎率；导电率测定法：利用破碎前后导电率变化来测定破碎程度。,细胞破碎的方法和破碎率