离心机操作及血液样本处理PPT课件

实验基础技能培训,李玉涛2017-07,1,.,Part1血液基本成分及其分离方法Part2离心机简介及使用,2,.,Part1血液基本成分及其分离方法,一、血液基本成分二、血液物理性质三、血液采集常用方法四、血液成分分离方法,3,.,一、血液基本成分,血细胞形态、数量、比例和血红蛋白含量的测定称为血像。患病时，血像常有显著变化，故检查血像对了解机体状况和诊断疾病十分重要。,4,.,1、红细胞,红细胞（erythrocyte，redbloodcell）直径78.5m，呈双凹圆盘状，中央较薄（1.0m），周缘较厚（2.0m）红细胞的这种形态使它具有较大的表面积（约140m2），便于携O2和部分CO2。成熟红细胞无细胞核，也无细胞器，胞质内充满血红蛋白（hemoglobin,Hb）。红细胞的渗透压与血浆相等，使出入红细胞的水分维持平衡。当血浆渗透压降低时，过量水分进入细胞，细胞膨胀成球形，甚至破裂，血红蛋白逸出，称为溶血（hemolysis）,5,.,2、白细胞,白细胞（leukocyte,whitebloodcell）为无色有核的球形细胞，体积比红细胞大，能作变形运动，具有防御和免疫功能。,6,.,白细胞分类,光镜下，根据白细胞胞质有无特殊颗粒，可将其分为有粒白细胞和无粒白细胞两类。有粒白细胞又根据颗粒的嗜色性，分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。无粒白细胞有单核细胞和淋巴细胞两种。,7,.,2.1、中性粒细胞,中性粒细胞（neutrophilicgranulocyte,neutrophil）占白细胞总数的50%70%，是白细胞中数量最多的一种。具有活跃的变形运动和吞噬功能。细胞呈球形，直径1012m，核染色质呈团块状。核的形态多样，有的呈腊肠状，称杆状核；有的呈分叶状，叶间有细丝相连，称分叶核。,8,.,中性粒细胞异常,中性粒细胞增高见于：a急性感染和化脓性感染：肺炎、败血症、脓肿等。b组织损伤：大手术后、心肌梗塞、肺梗塞等。c恶性肿瘤：急、慢性白血病、淋巴瘤等。d各种中毒：尿毒症、糖尿病酸中毒等。中性粒细胞减少见于：a某些传染病：流感、伤寒、付伤寒、麻疹。b某些血液病：再障、粒细胞缺乏症、白细胞减少症。c化疗或放疗后，抗癌药物，X线及镭照射。d其它：脾功能亢进，自身免疫性疾病，高度恶病质。,9,.,2.2、嗜酸性粒细胞,嗜酸性粒细胞（eosinophilicgranulocyte,eosinophil）占白细胞总数的0.5%3%。与变态反应有关，并有吞噬抗原抗体复合物的作用。细胞呈球形，直径1015m，核常为2叶，胞质内充满粗大（直径0.51.0m）、均匀、略带折光性的嗜酸性颗粒，染成桔红色。,10,.,嗜酸性粒细胞异常,嗜酸性粒细胞增多见于：a变态反应性疾病：支气管哮喘、药物过敏、荨麻疹等。b寄生虫病：蛔虫病、钩虫病、血吸虫病。c某些皮肤病：湿疹、牛皮癣、剥脱性皮炎等。d某些血液病：慢粒、恶性淋巴瘤、嗜酸性粒细胞性白血症等。嗜酸性粒细胞减少见于：a应用糖皮质激素、促肾上腺皮质激素。b伤寒、副伤寒等病患者。,11,.,2.3、嗜碱性粒细胞,嗜碱性粒细胞（basoophilicgranulocyte,basophil）数量最少，占白细胞总数的00.15。细胞呈球形，直径1012m。胞核分叶或呈S形或不规则形，着色较浅。胞质内含有嗜碱性颗粒嗜碱性粒细胞主要参与特殊的免疫反应。,12,.,嗜碱性粒细胞异常,增多见于：a慢性粒细胞白血病、嗜碱性粒细胞白血病。b某些转移癌及骨髓纤维化。减少一般无临床意义。,13,.,2.4、淋巴细胞,淋巴细胞（lymphocyte）占白细胞总数的20%30%，圆形或椭圆形，大小不等。T细胞约占淋巴细胞总数的75%，参与细胞免疫，如排斥异移体移植物、抗肿瘤等，并具有免疫调节功能。B细胞约占血中淋巴细胞总数的10%15%。B细胞受抗原刺激后增殖分化为浆细胞，产生抗体，参与体液免疫。,14,.,淋巴细胞异常,增多见于：a某些病毒或细胞所致的传染病：传染性淋巴细胞增多症、传染性单核细胞增多症、传染病恢复期、结核病、百日咳。b淋巴细胞性白血病、白血性淋巴肉瘤。减少见于：a应用肾上腺皮质激素、接触放射线。b细胞免疫缺陷病、某些传染病的急性期。,15,.,2.5、单核细胞,单核细胞（monocyte）占白细胞总数的3%8%。具有游走性和吞噬作用。单核细胞为白细胞中体积最大的细胞。直径1420m，呈圆形或椭圆形。胞核形态多样，呈卵圆形、肾形、马蹄形或不规则形等。胞质较多，呈弱嗜碱性，含有许多细小的嗜天青颗粒,16,.,单核细胞异常,增多见于：a某些感染：伤寒、结核、疟疾、黑热病、亚急性细菌性心内膜炎。b某些血液病：单核细胞性白血病、淋巴瘤、骨髓异常增殖综合症、恶性组织细胞病。减少一般无临床意义。,17,.,二、血液物理特性,血液密度为1.0501.060103kg/m3，红细胞的密度为1.090103kg/m3，血浆的密度为1.0251.030103kg/m3。,18,.,血液的颜色,通常抽的是静脉血，所以外观看上去呈暗红色。若血含较多的是高铁血红蛋白或其他血红蛋白衍生物，则呈紫黑色。血浆（或血清）因含少量胆红素，看上去呈透明淡黄色；若含乳糜微粒，则呈乳白浑浊；若发生溶血，则呈红色血浆。,19,.,三、血液采集常用方法,红色试管帽采血管采血管中不含任何添加剂，适用于常规生化血清检验，对检验结果无影响，缺点：离心不到位或者温育时间不够，容易形成纤维蛋白，容易堵塞设备针孔,20,.,三、血液采集常用方法,紫色试管帽采血管采血管中含EDTA-K2抗凝剂，一般采取喷雾制作，使得抗凝剂均匀分布管壁，制备标本为全血，一般适用于常规的血液学检测,21,.,常用抗凝剂（1）,乙二胺四乙酸二钠（简称EDTANa2）抗凝原理：可螯合血液中的钙离子而阻止血液凝固。优点：抗凝作用强，且不改变血细胞的形态和体积，可防止血小板聚集。应用：适于血液学检验，但输血不能用。草酸盐合剂（草酸钾及草酸铵合剂）抗凝原理：夺取血中的游离钙而形成不溶解的草酸钙，而达到抗凝。优点：溶解度大，抗凝作用强。缺点：草酸钾使红细胞缩小约6，而草酸铵可使红细胞膨胀。应用：适于除红细胞压积容量测定的血液检验。,22,.,常用抗凝剂（2）,枸橼酸钠（柠檬酸钠）抗凝原理：与血中游离钙离子形成非离子化的可溶性的枸橼酸钙复合物，从而阻止血液凝固。优点：与血中游离钙离子结合松散。缺点：引起水及无机盐在血细胞及血浆之间分布的改变。应用：常用于血沉淀及输血时的抗凝，不适用于血液化学检验。肝素抗凝原理：阻止血中的凝血酶原转变为凝血酶，防止血凝。优点：抗凝作用强，不影响红细胞的大小，对血液化学分析干扰少。缺点：价格贵，抗凝时间短，其抗凝血做白细胞分数计数时，白细胞着色不佳。应用：血液有机成分、无机成分的分析。,23,.,四、血液成分分离,1血清血浆分离2白细胞分离2.1裂解红细胞法2.2Ficoll分离法,24,.,1、血清血浆的分离,血清和血浆的最大区别就是血清中不含纤维蛋白原紫色采血管颠倒混匀后，1200g离心10min，4度，取上清。红色采血管需用枪头搅匀后，1200g离心10min，4度，取上清,25,.,2.1、白细胞分离-裂解红细胞法,红细胞裂解液主要成分：NH4Cl，KHCO3，Na2EDTA红细胞裂解液裂解原理：氯化铵通过在其细胞膜进行氢氧根碳酸氢根和氯离子的交换，改变其渗透压，造成红细胞胀大破裂；外周血淋巴细胞受影响较少因其细胞膜的离子转运通道不同。,26,.,2.1、白细胞分离-裂解红细胞法,主要实验流程：将10X储存液稀释到1X工作浓度；加入血沉棕黄层的6-10倍体积的1X红细胞裂解液，吹打均匀冰上裂解10分钟。裂解完毕后，50ml离心管中液体应呈透明红色，且下方无红色沉淀。1500g，10min，4度离心，弃去上层液体，仅保留下层白色沉淀。,27,.,2.2、白细胞分离-Ficoll分离法,原理:常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是1.0770.001的聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(FH)分层液。Ficoll是蔗糖的多聚体，中性，平均分子量为400,000，不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。,28,.,2.2、白细胞分离-Ficoll分离法,29,.,Part2离心机简介及使用,30,.,1、离心机简介,离心机借助转轴高速旋转产生离心力，使不同密度、不同大小的物质分开，能达到初步分离纯化的目的，是实验室必不可少的仪器。按照转速可以分为低速(50000)三种类型。根据体积大小和摆放位置又可分为台式离心机和落地式离心机。台式离心机体积比较小，常是中低速离心机；落地式离心机体积较大，常带有降控温装置，大多是高速离心机。,31,.,2、离心机的摆放,离心机一般放在干燥、避免阳光直射的地方。离心机散热量比较大，周围不要堆放杂物，四周离墙壁、挡板等不透气、散热性差的物品至少10cm以上。离心机尽量单独放在一个房间，周围绝对不要放有机试剂、易燃品,32,.,3、离心机使用注意事项,根据实验所需和使用的离心管，含有有机试剂的液体要用特殊的离心管；选择合适的转头，转速绝对禁止超过转头标明的最高转速。离心管的对称放置和重量配平，同时应该注意离心管和转头可以承受的最大重量的溶液，液体最多装离心管全体积的3/4。,33,.,4、离心机保养,每次使用完毕，都要将离心机盖儿打开，使得热量或者水气自然蒸发，如之前使用了低温离心，可能有结冰，则要等冰融化，及时用干燥棉纱布擦洗干净，等无明显水汽时再盖上盖子。如果离心机转头可以替换，则每个转头使用完毕后都要及时取出，用干净的、干燥的医用纱布擦洗干净，倒扣放置，切勿使用锐器刮擦。操作人员离开时候要切断电源。,34,.,5、具体操作流程（1）,1.设定使用温度（通常为4）后，先把离心陀放入离心舱中，注意离心陀要卡好轴心；关上舱门，离心舱的温度开始下降，预冷时间要充足。2.把样本装入适当的离心管，双双用天平平衡重量，盖上离心管盖子并旋紧。1）注意离心管只装七成满，虽然加有盖子，但也可能因离心力太强而外泄。2）离心管通常都会放在碎冰上，注意取出平衡时，要把碎冰的液体擦拭干净。3）落单的离心管要用另一只装有清水的离心管平衡。3.把平衡好的离心管对称地放入离心陀中，盖上离心陀的盖子，注意有无旋紧。4.关上离心机舱门，在仪表板上调好所要的转速与时间。5.确定所有步骤无误后，按Start钮开动，离心机渐渐加速，此时要密切监控。1）如在运行中听到不正常声音或者闻到什么异味，应立即采取刹车，按“停止”键，必要时还要切断电源。2）仪器运行期间，绝对禁止打开离心机盖3）等到离心达到所要的转速后，确定一切正常才可离去,35,.,5、具体操作流程（2）,6.完成离心时，要等离心陀完全静止后，才能打开舱门；请尽快取出离心管，先观察离心管是否完全，