荧光光谱分析法-PPT课件

. 1，2，2008年诺贝尔化学奖，下村修现年80岁，出生于1928年京都府，1960年获得名古屋大学理学博士学位后赴美，曾在美国普林斯顿大学、波士顿大学、伍兹霍尔海洋生物实验所工作。 他在1962年从水母中发现了荧光蛋白，被称为生物发光研究的第一人。 马丁费马丁费马丁出生于1947年，现年61岁，美国哥伦比亚大学生物学教授。 他获奖的主要贡献是绿色荧光蛋白作为发光的基因标签，该技术被广泛应用于生理学和医学等领域。 瑞典皇家科学院8日宣布，美国国籍中国科学家钱永健、美国生物学家马丁夏尔菲和日本有机化学家海洋生物学家下村修共同获得2008年度诺贝尔化学奖，平均获得1000万瑞典克朗(约140万美元)奖金。 获奖的是绿色荧光蛋白。 这种蛋白质给生物和医学实验带来了革命，它发出的荧光就像明亮的灯光，帮助研究人员在生命体的分子水平和细胞水平上照射出许多反应。 由于绿色荧光蛋白在紫外线照射下会产生鲜明的绿色光，研究人员应将绿色荧光蛋白基因插入动物、细菌或其他细胞的遗传信息中，并随之复制细胞，以“照亮”持续生长的癌肿，追踪阿尔茨海默病对大脑的损害，观察有害细菌的生长. 3、4、被荧光抗体染色的原生动物、澳大利亚科学家最近发现的被称为“虾”的海洋动物，通过发出色彩鲜艳的荧光来警告敌对者和有魅力的配偶，5、K.Brejcet.al .PNAS94(1997)2306， green-fluorescentprotein(GFP )、6第5章荧光分析法、第1节荧光分析法的基本原理第2节荧光定量分析法第3节荧光分光光度计、第7节荧光分光光度计除了吸收某个波长的光以外，还发出比本来吸收的光长的波长的光。 光致发光、荧光分析法是从物质荧光光谱线的位置和强度进行物质鉴定和含量测定的仪器方法。8、分子荧光分析特点：灵敏度高：一般紫外可见分光光度法的检出限约为10-7g/ml，荧光分析法的检出限可达10-10至10-12g/ml。 选择性好线性范围广应用范围窄，9、第一节荧光分析法的基本原理，1 .分子荧光的产生，另一方面分子荧光molecularfluorescence，分子能级比原子能级复杂，每电子能级振动，旋转能级室温下多分子处于基态的最低振动能该分子所处的电子能量状态称为基态单重状态，用符号S0表示，10、分子吸收放射线时，电子被激励而不发生自旋方向变化的ms为1/2和-1/2、s=0、M=1。 该分子所处的电子能态称为激发单重态，用符号s表示。 (S1S2S3)电子被激励，随着自旋方向的变化，ms为1/2和1/2，s=1，M=3。 该分子所处的电子能量状态称为激发三重状态，用符号t表示。(T1T2T3)、S0、11，总结：分子能级和迁移基态(S0)激发状态：吸收特定频率辐射的量化迁移一次到达的激发状态基态：各种路径和方式(参照能级图)速度最快，激发状态寿命最短的路线占优势，发生概率较高的第一、第二、 第一、第二、电子激发三重状态T1、T2； 电子能级复用性M=2S 1，平行自旋比对自旋稳定(洪特规则)，三能级比对应的单能级低的大部分有机分子的基态处于单能级状态，12、S0S1、S2允许迁移，S0T1、T2禁止块迁移； 以其他方法进入(参照能级图)概率低的总结：由于激发单重状态和激发三重状态的不同激发单重状态分子中没有净电子自旋，因此在具有反磁性的激发三重状态中存在两个自旋平行电子，顺磁性的激发单重状态分子的平均寿命短(10-810-6s )， 激发三重状态长度(10-410s) ) )从基态单重状态向激发单重状态的激发容易与电子自旋方向的变化无关地发生，作为允许迁移的激发三重状态属于禁止迁移，14、激发状态基态的能量传递路径、电子在激发状态不稳定的状态下返回基态时，辐射迁移(发光) 和在无辐射迁移等中失去能量荧光： 10-710-9s、第一激发单重状态的最低振动能级基态磷光： 10-410s； 第一激发三重状态的最低振动能级基态，15，辐射和非辐射能量传递过程，振动缓和：以相同的电子能级，以热能交换形式从高振动能层向低邻接振动能层的迁移。 振动缓和发生的时间为10-12s，内转：相同多重状态的电子能级之间的能级的无辐射转移。 通过内部变换和振动缓和，高激发单重状态的电子反弹为第一激发单重状态的最低振动能级。 发生内部转换的时间为10-13s。 荧光发射：电子发射第一激发单重态的最低振动能层基态(荧光多为S1S0迁移)、波长为3的荧光，10-710-9s。 发出荧光的能量小于分子吸收的能量，波长长： 321； 系统间跨度：激发态电子自旋反转改变分子多重性的非辐射迁移。 当虽然块转变被禁止，但是在能量层中存在大的重叠时，S1T1可以在系统之间产生跳跃，并且通过自旋-轨道耦合执行。 10-6s，外部转换：激发态分子与溶剂和其他溶质分子碰撞引起的转移能的非辐射转移。 经常在S1或T1S0之外转换，减弱荧光或磷光或“消光”。磷光发光：电子第一激发三重状态最低振动能级基态(T1S0转变)发光速度慢： 10-4100s，磷光能量比荧光小的电子从S0进入T1的过程： (S0T1遮断转变) S0激发振动缓和内转移系统间横断振动缓和T1光停止后， 可持续一段时间.17，2 .荧光的激发光谱和荧光光谱exchitiationspecontrulmandfluorenceespectrum:(1)荧光的激发光谱，激发光谱：在不同的激发波长产生的物质发出某一波长的荧光绘制激发光谱：固定发光波长(选择最大发光波长)，用不同波长的入射光激发荧光物质，用荧光强度f绘制激发波长，就成为激发光谱。 荧光分子具有两个特征光谱：激发光谱和发光光谱(荧光光谱)。 在激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大，被称为最大激发波长ex，(2)荧光的发光光谱(荧光光谱)，荧光光谱表示发光的荧光中的各波长成分的相对强度。 在产生发光光谱时，将激发光波长固定为ex，扫描发光光谱，测量各波长下相应的荧光强度，用荧光强度f绘制发光波长，得到发光光谱图(即荧光光谱)。发光光谱(荧光光谱)的位置是？ 磷光光谱的位置是什么？20、激发光谱与发光光谱的关系、a.Stokes位移荧光光谱始终位于物质激发光谱的长波侧，即荧光波长大于激发光波长的现象。 激发光谱与发光光谱的波长差：振动缓和、外部转换等无辐射迁移损失了一部分能量。 b .荧光光谱的形状与激发波长无关，电子转变为不同的激发态能级，吸收不同波长的能量(例如能级图2、1 )，产生不同的吸收带，但荧光光谱只是一个发射状态，例如3。 为什么？21，c .镜像规则因为电子基态的振动态分布与激发态相似，通常荧光光谱及其激发光谱处于镜像对称关系。 各小峰的波长减少值与振动能级差有关，各小峰的高度与迁移概率有关。 基态上的各振动能级分布与第一激励状态上的各振动能级分布类似，基态上的某个振动能级向第一激励状态的某个振动能级转变的概率大时，相反转变也是同样的。 1 .分子产生荧光所需的条件(1)具有适当的结构；(2)具有一定的荧光量子产率； 荧光量子产率():物质的荧光量子产率范围一般是多少？ 分子吸收的光子全部放出来的话，其量子收率会达到100%。24、2 .有机化合物分子结构与荧光的关系-的荧光效率高，体系间跃进过程的速率常数小，有利于荧光的产生；(2)共轭效应：提高共轭度有利于荧光效率的增加和红移的产生；(4)取代基效应：芳香环中有供电子基团，增强荧光(3)刚性平面结构：由于能够减少分子振动，减少与溶剂的相互作用，因此具有强荧光。 例如，荧光素和苯酚酞具有相似的结构，荧光素具有强荧光，但没有苯酚酞。 影响荧光强度的因素relationbetweenfluorescenceandremoreclarstructure，影响荧光强度的外部因素1 .在溶剂的影响相同的物质中，荧光光谱的形状和强度有差异。 一般来说，荧光波长随着溶剂极性的增大而变长，荧光强度也变强。 这是因为，在极性溶剂中，*迁移所需的能量差e小，并且迁移概率增加，紫外吸收波长和荧光波长都长时间迁移，强度也变强。 溶剂粘度减小可增加分子间碰撞的机会，增加无辐射迁移减弱荧光。 因此，荧光强度随着溶剂粘度的减小而减弱。 温度影响溶剂的粘度，因此一般温度上升，溶剂的粘度变小，因此温度上升，荧光强度下降。27，2 .温度的影响荧光强度对温度变化敏感，温度增加，分子运动速度加快，分子间碰撞概率增加，外灭活概率增加，荧光效率降低。 例如，荧光素钠的乙醇溶液在0以下，温度每下降10就增加3%，在80变为1。 当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的pH值很大程度上影响荧光物质的荧光强度。 这主要是因为不同酸度下分子和离子的平衡发生变化，离子结构发生变化，荧光强度也存在差异。 每一个荧光物质具有它的最佳发光荧光存在形态，即其最佳pH范围。 例如，苯胺如果pH不同，则在pH712的溶液中主要作为分子存在，nh2是提高荧光效率的取代基，因此苯胺分子产生蓝色荧光。 但是，由于pH2和pH13的溶液中存在苯胺离子，因此不能发出荧光。 3 .溶液pH对酸碱化合物、溶液pH的影响大，需要严格控制，29、4 .内滤作用和自吸收现象，自吸收现象：化合物荧光发光光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收的蒽化合物等。内滤光作用：溶液中含有激发光和吸收荧光物质发出的荧光，例如色氨酸中的重铬酸钾的荧光，30，5 .荧光熄灭剂，荧光熄灭是指荧光物质分子与溶剂分子和溶质分子相互作用，荧光强度降低的现象。 引起荧光熄灭的物质叫荧光熄灭剂。 例如卤离子、重金属离子、氧分子和硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物和羧基化合物都是常见的荧光灭火剂。31，6，散射光，部分光子与物质分子碰撞，改变光子的运动方向使其散射到不同的角度。 瑞利光：光子与物质发生弹性碰撞，不发生能量交换，只改变光子运动的方向。 其波长与入射光的波长相同。 拉曼光：光子与物质发生弹性碰撞，发生能量交换，光子将能量的一部分转移到物质分子中，或从物质分子中得到能量的一部分。 出射比入射光稍长或短的光。 散射光对荧光测定有干扰，特别是波长比入射光波长长的拉曼光接近荧光波长，对测定有很大干扰，必须采取对策。 拉曼光的干涉主要来自溶剂，溶剂拉曼光与待测物质荧光光谱重合时，必须更换溶剂或改变激发光的波长。 32、选择适当的激发波长可消除拉曼光的干涉，a 3360 nm或350nm为激发光，荧光峰始终为448nm。 b:分别以320nm及350nm激发光照射空白溶剂来测定荧光，激发光波长为320nm时，拉曼波长为360nm，360nm的拉曼光对荧光产生影响硫酸奎宁在不同波长下激发的荧光和散射光谱、33、4、荧光试剂、荧光试剂是与非荧光物质或弱荧光物质反应得到强荧光产物的标记物，可以扩大荧光分析法的使用范围，1 .有机化合物的荧光分析、脂肪族化合物很少发生荧光。 具有芳香族或芳香结构的化合物，由于存在共轭体系，因此容易吸收光能，通过紫外光的照射发出荧光的情况较多。 为了提高测定的灵敏度和选择性，使弱荧光性物质和某些荧光试剂发挥作用，可以得到强荧光性产物(诱导化)。 因此，荧光分析法在有机物测定中的应用广泛。 34、荧光分析法可测定有机物为多环胺类、萘酚类、嘌呤类、吲哚类、多环芳香族烃类、具有芳香环或芳香族杂环结构的氨基酸类及蛋白质等药物中的生物碱类，例如麦角菌素、蛇根碱、麻黄碱、吗啡、醌青霉素、四环素等抗生素类； 维生素类，例如维生素a、B1、B2、B6、B12、e、抗坏血酸、叶酸、烟酰胺等. 此外，中药的许多有效成分是属于芳香结构的高分子杂环类，能产生荧光，用荧光分析法进行初步鉴别和含量测定。 荧光分析法灵敏度高，选择性好，采样量少，方法快，已成为医学药学、生物学、农业和工业等领域科研的重要手段之一。 以下是一些重要的荧光试剂：1 .荧光素：可与脂肪族和芳香族伯胺类形成高度荧光衍生物，典型的反应如下：荧光胺及其水解物不显示荧光。 荧光胺100mg溶解于丙酮酐100ml中，放置24小时即可使用。 取相当于药物10mg的甲醇或水溶液0.lml，加入适合pH的磷酸缓冲溶液5ml，加入荧光胺试剂0.lml混合，放置15分钟测定荧光强度。 荧光条件为ex=275、390nm、em=480nm。 36，2 .苯二甲醛(OPA )在2 -巯基乙醇存在下，pH910缓冲溶液中的OPA生成伯胺类，特别是半胱氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸以外的a氨基酸和敏锐的荧光生成物。将500 mg opa溶解于10ml乙醇中，加入200ml巯基乙醇，将该混合液加入1L3%的硼酸溶液中，用KOH调整pH10是一般的试剂溶液。 荧光条件为ex=340n