酶工程制药课件

第四章,酶工程制药教学目的掌握：酶工程制药的概念熟悉：固定化酶、固定化菌体的定义和特点教学重点:固定化酶,第一节概述,酶工程是酶学和工程学相互渗透结合、发展而形成的一门新的技术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异催化性能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。一、酶工程发展概况酶工程起源于酶的生产与应用技术发展。酶工程的名称出现在20世纪20年代，主要指自然酶制剂在工业上的规模应用。1833年，Payen和Persoz首先发现酶。1857年，Pasteur提出酒精发酵是酵母细胞活动结果。1878年，Knne提出“酶”（Enzyme)这个名称。1894年，日本高峰让吉从米曲霉中制得高峰淀粉酶，作消化剂。开创了有目的地进行酶的生产和应用的先例。,1897年，德国的Bchner兄弟成功地用不含细胞的酵母汁实现了发酵，证明了发酵与细胞无关。1908年，德国的Robm制得胰酶用于皮革的软化。法国的Boidin制得细菌淀粉酶用于纺织品的退浆。1911年，美国的Wallerstein制得木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白质浑浊。1913年，Michaelis提出了酶的动力学说。1916年，美国的Nelson和Griffin发现酶与载体结合后，在水中呈卜溶状态时仍具有催化活性的现象。1926年，Sumner第一次从刀豆中提出脲酶结晶，并证明酶具有蛋白质性质。1930年，Northrop分离出结晶的胃蛋白酶、胰蛋白酶及凝乳蛋白酶，并进行了动力学探讨，确立了酶的蛋白质本质。1953年，德国的Grubhofer和Schleith将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，然后与各种酶结合而制成固定化酶。他们首先提出了固定化技术。,1960年，法国的Jacob和Monod提出了操纵子学说，阐明了酶生物合成的调节机理。1969年，日本的千烟一郎在工业上应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸生产L-氨基酸，即首先采用固定化技术拆分了DL-氨基酸。1971年，第一届国际酶工程会议提出酶工程的主要内容：酶的生产、分离纯化、酶的固定化、酶及固定化的反应器、酶和固定化酶的应用。1982年，切克(Cech)等发现核糖体(RNA)也具有催化活性。酶的应用研究20世纪50年代：大规模的酶工业化生产建立；60年代：酶固定化，酶分子化学修饰，酶电极问世，酶标免疫技术建立；70年代：微生物细胞固定化；80年代：动植物细胞固定化；近年来，抗体酶，人工酶和模拟酶研究。,二、现代酶工程的主要内容a、酶的分离纯化、大批量生产及新酶和酶的应用开发；b、酶和细胞的固定化及酶反应器的研究，包括酶传感器、反应检测；c、酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶的研究；d、酶的分子改造和化学修饰，结构与功能的研究；e、有机相中酶反应的研究；f、酶的抑制剂、激活剂的开发与应用研究；g、抗体酶、核酸酶的研究；h、模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成研究。三、酶的概念及特性酶是由活细胞产生的具有特殊催化功能的一类蛋白质。酶是生物催化剂，其特点：催化效率高;专一性强;反应条件温和催化活性受到调节和控制.,所有生物体在一定条件下都可以合成多种多样的酶。生物体内的各种生化反应，几乎都是在酶的催化作用下进行的，所以酶对于生物体的新陈代谢是至关重要的。四、酶的分类与命名根据国际酶学委员会的建议，每种具体的酶都有其推荐名和系统命名。酶的推荐名，是在惯用名称的基础上，加以选择和稍加修改而成。一般由两部分组成：(1)底物的名称，(2)催化反应的类型后面加一个“酶”字（ase）。例如，葡萄糖氧化酶，表明该酶作用底物是葡萄糖，所催化的反应类型属于氧化反应。对于水解酶类，催化反应的类型为水解反应，在命名时可省去“水解”字样。有时还在底物名称前面在加上酶的来源，如胰蛋白酶。系统命名包括了酶催化作用的底物，酶作用的基团以及催化反应的类型。,系统命名法根据酶所催化的反应类型，将酶分成六大类。即：第l类，氧化还原酶；第2类，转移酶；第3类，水解酶；第4类，裂合酶；第5类，异构酶；第6类，连接酶(或称合成酶)。每种酶都有其一定的系统编号,系统编号采用四码编号方法，每个号码之间用圆点(.)分开。第一个号码表示该酶属于六大类中的某一类，第二个号码表示属于该类中的某一亚类，第三个号码表示属于该亚类中的某一小类，第四个号码表示这一具体的酶在该小类中的序号。如，乙醇脱氢酶EC1.1.1.1,EC-国际酶学委员会,反应类型,第二节酶的来源和生产菌,一、酶的来源多数酶的生产目前只宜直接从生物体中提取分离。,一、酶的来源多数酶的生产目前只宜直接从生物体中提取分离。早期酶的生产多以动植物为主要原料，如激肽释放酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶。近10年来，研究发展了动植物组织培养技术，但周期长、成本高。工业生产一般都以微生物为主要来源。目前使用的千余种商品酶，大多数是微生物生产的。其特点是：A、微生物种类繁多，凡是动植物体内存在的酶，几乎都从微生物中得到。B、微生物繁殖快、生产周期短、培养简便，并可通过控制培养条件来提高酶的产量。C、微生物具有较强的适应性，通过各种遗传变异的手段，能培育出新的高产菌珠。,二、酶的生产菌对菌种的要求a、产酶量高，酶的性质符合使用要求，而且最好是产生胞外酶的菌；b、不是致病菌，在系统发育上与病原体无关，也不产生毒素；c、稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体；d、能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。生产菌的来源a、菌种保藏机构和有关研究部门获得；b、大量要从自然界中分离筛选；自然界是产酶菌种的主要来源，土壤、深海、温泉、火山、森林等都是菌种采集地。,筛选产酶菌的方法：采集、菌种的分离初筛、纯化、复筛和生产性能检定等。菌种改良的途径：应用遗传学原理进行基因突变、基因转移和基因克隆。3.目前常用的产酶微生物A、E.coli：是应用最广泛的产酶菌。分泌胞内酶，经细胞破碎分离得到。在工业上用于生产谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、青霉素酰化酶、-半乳糖苷酶。B、枯草杆菌：主要用于生产-淀粉酶、-葡萄糖氧化酶、碱性磷酸脂酶。C、啤酒酵母：用于酿造啤酒、酒精、饮料、面包等。D、曲酶（黑曲酶和黄曲酶）：主要生产糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶和脂肪酶。,E、其他产酶菌：青霉菌、木霉菌、根霉菌、链霉菌等。第三节酶和细胞固定化一、固定化酶和细胞的制备固定化酶的定义（immobilizedenzyme）固定化酶是指限制或固定于特定空间位置的酶,具体来说是指经物理或化学方法处理,使酶变成不易随水流失即运动受到限制,而又能发挥催化作用的酶制剂。制备固定化酶的过程称为酶的固定化。固定化所采用的酶,可以是纯化的酶,也可以是结合在菌体（细胞）或细胞碎片上的酶或酶系。固定化酶的特点具有生物催化剂的功能,又有固相催化剂的功能。,什么是固定化酶？,可多次使用。反应后,酶底物产物易分开,产物中无残留酶,易纯化,产品质量高。反应条件易控制。酶的利用效率高。比水溶性酶更适合于多酶反应。,酶的固定化技术和固定化酶,酶和细胞固定化方法载体结合法交联法包埋法网格型微囊型物理吸附法离子结合法共价结合法热处理（细胞）,3、酶和细胞的固定化方法1）载体结合法：将酶结合于不溶性载体上的固定化方法。包括物理吸附法用物理方法将酶吸附于不溶性载体上的固定化方法。,优点：操作简单，可选用不同电荷和不同形状的载体，有可能固定化和纯化过程同时实现，酶失活后载体仍可再生。缺点：最适吸附酶量无规律可循，吸附量与酶活力不一定呈平行关系，酶与载体结合力不强，酶易于脱落，导致酶活下降并污染产物。,Figure4-1Immobilisedenzymesystems.(a)enzymenon-covalentlyadsorbedtoaninsolubleparticle;(b)enzymecovalentlyattachedtoaninsolubleparticle;(c)enzymeentrappedwithinaninsolubleparticlebyacross-linkedpolymer;(d)enzymeconfinedwithinasemipermeablemembrane.,离子结合法酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体上。优点：操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏。缺点：载体和酶的结合力弱，易受缓冲液种类或pH的影响，离子强度高时，酶易脱落。共价结合法：酶以共价键结合于载体上。即将酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。优点：酶与载体结合牢固，稳定性好，不易脱落。缺点：载体要活化，反应条件苛刻，操作复杂，反应条件剧烈，酶易失活和产生空间位阻效应。2）交联法：用双功能或多功能试剂使酶与酶或细胞与细胞之间交联的方法。交联法又分为交联酶法、酶与辅助蛋白交联法、吸附交联法和载体交联法。,共价偶联法,常用的交联剂：戊二醛、双重氮联苯胺-2、2-二磺酸、1,5-二氟-2,4-二硝基苯。3)包埋法将细胞定位于凝胶网格内或半透膜中的技术。网格型将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中。常用合成高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂。天然高分子化合物有淀粉、明胶、胶原、海藻胶、角叉菜胶。多用于固定化细胞。,微囊型,微囊型将酶或细胞包埋在高分子半透膜中。通常为直径几微米到几百微米的球状体。颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，但反应条件要求高，制备成本也高。4）选择热变性法将细胞在适当温度下处理使细胞膜蛋白变性但不使酶变性而使酶固定于细胞内的方法。此法专用于细胞固定化。4、固定化酶的制备吸附法制备固定化酶技术将酶的水溶液与具有高度吸附能力的载体混合，然后洗去杂质和未吸附的酶即得固定化酶。,包埋法制备固定化酶技术凝胶包埋：先将凝胶材料与水混合，加热使之溶解，再降至其凝固点以下的温度，然后假如预保稳的酶液，混合均匀，最后冷却凝固成型和破碎即成固定化酶。微囊化包埋：将酶定位于具有半透膜的微小囊内。半透膜厚约20nm，膜孔径40nm.其表面积与体积比很大，包埋酶量也多。界面沉降法和界面聚合法交联法制备固定化酶技术共价结合法制备固定化酶技术5、固定化细胞的制备1）固定化细胞的定义将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞。固定化细胞主要是利用细胞内酶和酶系，比固定化酶应用普遍。,2）固定化细胞的特点有细胞特性，生物催化剂功能，固相催化剂特点。优点：无须进行酶的分离纯化保持酶的原始状态，酶回收率高比固定化酶稳定性高细胞内酶附助因子可再生细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应抗污染能力强。3）固定化细胞的制备技术是固定酶技术的延伸，因此其方法和技术基本相同。细胞固定化主要适用于胞内酶，要求底物和产物容易透过细胞膜。载体结合法将细胞悬液直接与不溶水载体相结合。包埋法将细胞定位于凝胶网格内的技术。交联法多功能试剂对细胞进行交联的固定化方法。无载体法靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞的技术。,三、固定化载体的选择与依据1、酶和细胞的固定化载体吸附载体离子吸附和物理吸附,物理吸附包括无机物和有机物吸附（比如,矾土/活性碳和纤维素）。包埋载体卡拉胶、海藻胶共价结合载体纤维素、SephadexA200、琼脂、琼脂糖、苯胺多孔玻璃、聚丙烯酰胺。载体应具备的条件：（1）固定化过程中不引起酶变性；（2）对酸碱有一定的耐受性；（3）有一定的机械强度；（4）有一定的亲水性和稳定性；（5）有一定的疏松网状结构，颗粒均匀；（6）共价结合时有可活化基团；（7）有耐受酶和微生物细胞的能力；,（8）廉价易得。2、固定化方法的选择一种酶固定可以采用不同的固定方法；同样，不同种酶可采用一种相同的固定方法。至于选择什么固定化方法，应考虑以下几个因素：固定化酶应用的安全性;固定化酶在操作中的稳定性;固定化的成本。3、载体的选择载体的选择除了载体材料本身的特性外，还应考虑底物的性质。三、固定化酶或细胞的形状与性质固定化酶或细胞的形状制备何种形状的固定化酶或细胞，需根据底物和产物的性质、基质材料的性能、固定化的方法、酶反应的性质以及反应器类型和应用目的来决定。以固定化酶为例：颗粒状固定化酶；纤维状固定化酶；膜状固定化酶；管状固定化酶。,固定化酶的性质采用的方法及载体的不同，固定化酶可能会受到扩散限制、空间障碍、微环境变化和化学修饰等因素的影响，从而可导致酶学性质和酶活力的变化。酶活力的变化活力下降的原因：酶分子空间构象发生变化，影响了活性中心的氨基酸。空间位阻效应,影响了活性中心对底物的定位作用。内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻。包埋使半透膜使大分子物质不能透过膜与酶接近。酶稳定性的变化操作稳定性；贮藏稳定性；热稳定性；对蛋白酶的稳定性。操作稳定性通常用半衰期（即固定化酶的活力下降为最初活力一半时所经历的连续操作时间）表示。,一般半衰期达1月以上时，就具有工业应用价值。半衰期t1/2=0.693/KDKD为衰减系数，KD=-2.303lg(E/E0)/tE0为起始酶活力，E为时间t后残留酶活力。热稳定性越高，工业化的意义就越大。热稳定性高可以提高反应温度，进而提高反应速度和效率。酶学特性的变化天然酶经过固定化后,下面一些特性均可能发生变化。底物专一性.由于位阻效应，高分子底物的活性会明显下降。最适pH.其变化于酶蛋白和载体的带电性质有关。最适温度.大多数酶经固定化后，最适温度升高。米氏常数(Km).Km值表示酶和底物的亲和力大小的客观指标。最大反应速度(Vmax)。3、固定化细胞的性质无论采用哪种细胞的固定化，都需要采用适当的措施来提高细胞膜的通透性，一提高酶的活力和转化效率。,四、评价固定化酶(细胞)的指标1、固定化酶(细胞)活力测定酶活力:在单位时间内单位体积中的底物减少量或产物增加量来表示。1961年，国际生物化学联合会规定：在特定的条件下(温度可采用25或其他选用温度，pH等条件均采用最适条件)，每分钟催化1mol底物转化为产物的酶量，定义为1个酶活力单位。这个单位称为酶的国际单位(IU)。其活力测定方法：（1）振荡测定法;（2）柱法测定;（3）连续测定;（4）固定化酶的比活力测定;（5）酶结合效率与酶活力回收率的测定;（6）相对酶活力测定1）分批测定法是固定化酶在搅拌或振荡的情况下进行测定的方法，与天然酶的测定方法基本一致，即间隔一定时间取样测定的方法。,2）连续测定法不管是分批、连续或是填充反应器，都可以引出反应液进行测定。2.偶联率及相对活力的测定影响酶固有性质诸多因素的综合效应，以及固定化期间引起的酶失活，可用偶联率或相对活力来表示。固定化酶的活力回收率是指固定化后固定化酶（细胞）所显示的活力占被固定的等当量游离酶（细胞）总活力的百分率。偶联率=1，表示反应控制好，固定化或扩散限制引起的酶失活不明显。偶联率1时，扩散限制对酶活力有影响。偶联率1时，有细胞分裂或从排除抑制剂等原因。第四节固定化酶和固定化细胞的反应器一、反应器的类型和特点,间歇式搅拌罐反应器(BSTR)用于游离酶反应后随即放料。连续流动搅拌罐反应器(CSTR)连续进料、连续出料添充床反应器(PBR)固定化酶添充于床层内。反应器内的流体的流动形态为平推流形。底物以恒定流速通过反应床。流化床反应器(FBR)底物以足够大的流速向上通过固定化酶床层，使固体颗粒处于流化状态，达到混合的目的。循环反应器(RCR)部分反应液流出和新加入底物流入液混合，在进入反应床进行循环。连续流动搅拌罐-超滤膜反应器(CSTR/UFR)由连续流动搅拌罐反应器和超滤装置组合而成的反应器。它在连续流动搅拌罐的出口处装有半透膜。,各种反应器的示意图,S底物，P产物，(a)间歇式搅拌罐反应器(b)连续流动搅拌罐反应器(c)连续流动搅拌罐-超滤膜反应器(d)填充床反应器(e)循环反应器(f)硫化床反应器,其它反应器还有淤浆反应器、滴流床反应器、气栓式流动反应器、转盘式反应器、筛板反应器以及不同类型反应器的组合等。二、反应器的选择依据根据固定化酶的形状来选择根据底物的物理性质来选择根据反应的动力学特性来选择根据外界环境对酶的稳定性的影响来选择根据操作要求及反应器费用来选择第五节酶工程研究的进展一、酶的化学修饰通过主链的切割、剪接和侧链基团的化学修饰对酶蛋白进行分子改造，以改变其理化性质及生物活性，这种技术称为酶分子的化学修饰。,酶的化学修饰的目的和意义可人为地改变天然酶的一些性质，创造其所不具备的某些优良特性，甚至创造出心得活性等。常用的化学修饰剂对化学修饰剂的要求；常用的化学修饰剂化学修饰的措施修饰酶的功能基团；小分子化合物氨基葡萄糖等。酶分子内或分子间进行交联双功能基团试剂。修饰酶的辅因子。酶与高分子化和物相结合。修饰酶的特性热稳定性提高；抗各类失活因子能力提高；抗原性消除；体内半衰期延长；最适改变；酶学性质变化；对组织分布能力改变。,固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸技术路线E.Coli斜面细胞固定化细胞青霉素G转化液滤液6-APA粗品,酶的化学修饰的应用及前景化学修饰法是研究酶一级结构与活力关系的主要方法之一，近年来发展了一些新的研究技术：过度态类似物技术；自杀性底物技术；基因定位突变技术；计算机模拟技术等。化学修饰可以改变天然酶各种活性,扩大酶的应用范围。化学修饰法是改造酶分子的有效方法,而且已有了一定的规律性和普遍性,具有广泛的应用前景。,青霉素酰化酶转化流程图,第五节酶工程在制药工业中的应用酶促反应的专一性强,反应条件温和。酶工程优点：工艺简单、效率高、生产成本低、环境污染小、产品收率高、纯度好。第六节酶工程是生物技术的重要组成部分酶工程与发酵工程、基因工程和细胞工程具有密切的联系，相互依存，相互促进，构成完整的生物技术。（图1-1）常规菌（或常规细胞株）改造物种生物工程（学）工程菌（或工程细胞株）商品生产大量生产：经济效益、社会效益、生态效益,图1-1酶工程与发酵工程、基因工程和细胞工程的关系,基因工程,发酵工程,酶工程,酶,细胞工程,酶,细胞,菌体细胞,固定化菌体细胞,转基因动物,转基因植物,酶和酶工程研究的重要意义,酶工程是酶学基本原理与化学工程相结合而形成的一门新兴的技术科学。研究酶制剂大规模生产及应用所涉及的理论与技术方法。酶和酶工程研究有助于阐明生命的本质和活动规律；为催化剂设计，药物设计及疾病诊断治疗提供依据和新思路；蛋白质和核酸一级结构测定和基因工程研究中的重要工具；运用酶技