第8讲--成体干细胞及组织工程学

成体干细胞及组织工程学,临床血液教研室,1,什么是成体干细胞？（somaticstemcelloradultstemcells）,指存在于分化组织中的未分化细胞，具有自我更新、构建和补充相应组织中各种类型细胞的潜能。成体干细胞存在于机体的各种组织器官中。,2,主要的成体干细胞：,造血干细胞（hematopoieticstemcell,HSC）骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcell,MSC）神经干细胞（neuralstemcell,NSC）表皮干细胞（epidexmisstemcell,ESC）脐血干细胞（cordbloodstemcell）肿瘤干细胞（cancerstemcell）,3,CSCsandstemcellniche,在肿瘤细胞中存在着小部分的肿瘤干细胞（cancerstemcells,CSCs），是肿瘤形成、复发、转移和耐药的决定性原因和基础。,4,成体干细胞来源：,可能是胚胎细胞残留于机体，并在干细胞微环境的作用下保持静息状态。存留的组织需要修复，便在特定微环境下被激活并分化成所需的细胞。,5,成体干细胞三大特征：,自我更新种系定向分化能力：具有多能分化特性，能够分化为特定组织的多种细胞类型，但分化潜能有限。在特定组织定居：大多数成体干细胞处于休眠状态（G0期），病理因素或诱导后表现再生和更新能力，替代受损细胞或死亡细胞。,6,胚胎干细胞与成体干细胞,具有自我更新和分化形成任何类型细胞的能力，有形成完整个体的分化潜能。可分化成为全身200多种细胞类型，进一步形成机体的所有组织、器官。,胚胎干细胞全能干细胞(totipotentstemcell),7,多能干细胞能产生多种类型细胞的能力，但却失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。单能干细胞只能向单一方向分化，产生一种类型的细胞。,成体干细胞多能干细胞(pluripotentstemcell)或单能干细胞(unipotentstemcell),8,干细胞横向分化（transdifferentiation）,组织干细胞通过活化潜在的其他分化程序，改变了组织干细胞的特异性种系分化进程，可分化成其它组织细胞的能力。造血干细胞向非造血组织细胞分化、神经干细胞向血液系统细胞分化,9,造血干细胞（HSC）,胚胎期定位于胎肝（Fetalliver,FL）成年哺乳动物骨髓，外周血、脐带血转录因子MLL（mixed-lineage-leukemiagene），RunX1，TEL/ETV6，SCL/Tal1，LMO2对胚胎期HSC分化发育有重要调节作用。,10,HSC特性：,HSC的更新与分化：采用不对称的分裂方式：其中一个细胞仍然保持干细胞的一切生物特性，从而保持HSC数量相对稳定，这就是干细胞自我更新。另一个则进一步增殖分化为各类血细胞、前体细胞和成熟血细胞，释放到外周血中，执行各自任务，直至衰老死亡，这一过程是不停地进行着的,11,多向分化潜能自我更新,造血干细胞的分化：,11,造血干细胞微环境,血管周围微环境、骨内膜微环境：维持干细胞“干性”,13,造血干细胞的分离与鉴定,人HSC表面标志物：CD34+、Lin-、c-kit+、sca-1+，Thy-1,IL-7Ra,Flt3,CD150。流式细胞分选技术，免疫磁珠分选。HSC的功能鉴定：致死剂量放射线照射动物，HSC移植可以重建骨髓的造血功能，长期（16周）产生多系成熟血液细胞。,14,骨髓间充质干细胞(MSC),主要从骨髓中分离，胎盘、脂肪组织、脐血和肝脏也存在MSC。人MSC标志物：CD73+、CD90+、CD105+、CD45-小鼠MSC标志物：Sca-1+、CD90+、CD45-,15,16,MSC在低血清培养基中具贴壁优势特性，定期换液除去不贴壁细胞，可纯化及扩增MSC,全骨髓法,根据骨髓中各细胞成分比重的不同，分离单核细胞进行贴壁培养,密度梯度离心法,MSC的主要分离手段,流式或磁珠分选后的细胞出现增殖缓慢，成本较高、技术难度较大，限制了这些方法的广泛应用,流式细胞仪法、免疫磁珠法,17,向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等多种细胞分化,MSC的分化,骨髓中的多向分化干细胞（骨、软骨、脂肪、肌细胞、心肌细胞、成纤维细胞、肝细胞）；容易获得；体外扩增109倍仍不失多向分化潜能；外源基因容易插入；免疫原性较弱；常见的组织工程种子细胞,18,MSC的优点,肝干细胞的可能位置：位于Herings管区域内，直接参与肝脏的生长和发育，同时也是肝细胞再生的重要细胞来源。HSC、脐带血干细胞和MSC在一定培养条件下也可以向肝细胞分化。,肝干细胞(hepaticstemcell),19,角蛋白19(cytokeratin19,CK19)神经细胞粘附分子(neuralcelladhesionmolecule，NCAM)上皮细胞粘附分子(EpCAM)claudin-3(CLDN-3),人肝干细胞特征性标志物,20,细胞因子：成纤维细胞生长因子2(FGF-2)、人activinA、肝细胞生长因子(HGF)、骨形成蛋白2(BMP2)化学诱导剂：DMSO、地塞米松(Dex)、丁酸钠(NaB)、制瘤素(OSM),肝干细胞定向分化,肝干细胞诱导分化因子,21,实例：2000年8月，日本筑波大学把鼠肝干细胞体外培养后，移植到肝功能衰竭的鼠肝中，40天后干细胞发育成新的肝组织，分泌出鼠肝特异清蛋白。,肝干细胞定向分化,22,1992年Reynolds和Weiss首先从成年小鼠的纹状体和海马中分离出NSC。1998年，Okano报道，成人脑室下区存在神经干细胞。1999年，Johnasson证实，成年哺乳动物脑室管壁的室管膜细胞是神经干细胞。1999年，Doetsch报道，成年哺乳动物脑内室下区的星形胶质细胞是神经干细胞。,神经干细胞(NSC),NSC的可能位置,23,巢蛋白(nestin)：一个比较公认的神经干细胞标志物。仅在胚胎早期神经上皮表达，出生后停止表达。一旦神经前体细胞分化即停止表达A2B5蛋白Vimentin胶质细胞标志物(GFAP)等细胞表面抗原：CD133+/CD34-/CD45-；,NSC的表面标志物,24,帕金森病(Parkinsondisease，PD)阿尔兹海默病(Alzheimerdisease，AD)亨廷顿病(Huntingtondisease，HD),25,神经干细胞的临床应用,首都医科大学附属神经外二科主任黄红云等自2001年起在世界上率先开展流产胎（婴）儿嗅鞘细胞(一种NSC)移植治疗脊髓损伤。已经治疗近400例，部分完全性脊髓损伤患者恢复部分功能。,26,表皮干细胞(Skinstemcell,SSC),-SSC的来源或部位：表皮干细胞：基底细胞毛囊干细胞：毛囊膨胀部位的真皮乳头细胞团,27,表皮干细胞,-SSC特异生物标记：K4、K14角蛋白-SSC干性的体内维持：整联蛋白、钙黏连蛋白将SSC与基底膜细胞强烈黏附，维持SSC在干细胞巢中附着，并维持其增殖与干性-SSC的分化：Wnt信号激活SSC增殖分化,28,表皮干细胞终生都在更新；体外培养表皮干细胞技术已经非常成熟；治疗的效果易于观察，万一发生不良反应可方便地移去；,表皮干细胞特点与优势,29,1996，我国徐荣祥在烧伤创面上找到皮肤组织原位再生的原始细胞“角蛋白十九型皮肤干细胞”。并成功诱导其分化生成皮肤细胞，使受伤的皮肤得以迅速康复，实现人体器官原位再生，获得美国专利。,已经成功应用于遗传性水疱病、大疱性表皮松懈症的基因治疗,30,组织工程（TissueEngineering）,定义：应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理状态下的组织结构、功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。,31,种子细胞支架材料和细胞外基质细胞与材料的体外复合培养(细胞生长环境方式、应力，材料改性等)体内植入(材料生物相容度、降解与细胞功能的同步化、营养支持、血管生成等)检测和管理临床验证产业化,组织工程研究内容,32,种子细胞：,胚胎干细胞：存在伦理问题，来源不易。成体干细胞：易获得，自身的成体干细胞没有免疫原性。,33,体外途径：从病人体内获取细胞，体外培养并导入目的基因后，重新输入患者体内。体内途径：直接将基因或携带目的基因的经改造的病毒导入人体患病组织中。,34,干细胞定向分化的基因策略,选择安全、无毒、容易穿过细胞膜的基因载体，将治疗基因导入细胞内。理想载体的条件：易获得高滴度的纯品；能稳定、高效地转染体内非增殖状态的细胞；可以长期、稳定地表达外源基因而不会引起细胞毒性、感染或免疫应答；能特异地识别靶组织，在其中表达外源基因；,35,干细胞基因治疗关键问题,西班牙马德里自治大学博尔纳德教授和丹麦欧登塞大学医院布瑞恩斯(CancerRes,2005):体外培育人体间充质干细胞6-8周是安全的；超过4-5个月，这种干细胞会发生自发转化；体外培养8个月、分裂了90-140代的人体间充质干细胞移植至动物体内后，发现“最老的”细胞发生了癌变。,36,转基因干细胞安全性问题,原因端粒酶端粒酶有阻止端粒随细胞分裂而逐渐缩短的作用，从而稳定染色体的末端，在保持细胞“永生”性中起重要作用。干细胞的端粒酶基因活化，最终将其变成癌细胞。,37,ECM蛋白多糖、糖蛋白、胶原纤维ECM是细胞附着的基本框架和代谢场所，其形态和功能直接影响所构成的组织形态和功能。理想的ECM应具有以下特点生物相容性好有可吸收性有可塑性表面化学特性和表面微结构利于细胞的粘附和生长降解速率可根据不同细胞的组织再生速率而进行调整。,38,细胞外基质的研究,天然ECM：采用胶原制作人工皮肤和血管模型人工的ECM：聚乳酸、聚羟基乙酸、两者的共聚物(PGA-PLA)、聚-羟基丁酯(PHB)；聚乳酸-已内酯的共聚物(PLC)、聚原酸酯、聚磷本酯、聚酸酐天然高分子与合成高分子的复合物，如胶原-PCA的复合物等有机材料与无机材料的复合物，如羟基磷灰石-甲壳素的复合物，羟基磷灰石-PLA的复合物等,39,细胞外基质的研究组织工程所应用的材料,制备干细胞，诱导定向分化；建立由细胞和可降解材料构成的三维空间复合体；采用稳定的培养系统，是工程组织维持长期的分化状态。,40,组织工程(体外)实施的三大步骤,组织相容性；材料降解与细胞功能发挥的同步化；代谢活动，营养来源，血管化过程及方式；与生长发育的关系，细胞的作用及转归，植入体的最终结局；体内生物力学，免疫学；对药物治疗的反应。,41,体内植入研究,42,骨组织构建,构建组织工程骨的方式有几种,支架材料与成骨细胞；,支架材料与生长因子；,支架材料与成骨细胞加生长因子。,一名7岁男孩沈某因车祸造成颅骨66厘米缺损；采用组织工程技术构建的颅骨移植修复，经4个月随访，这块占颅骨总面积达1/6的组织工程化颅骨在人体内稳定存在，生长良好。,43,人工皮肤“Apligraf”已经在美国面市；Organogenesis公司研制的与人类皮肤相同的Apligraf，是第一个获得美国食品及药物管理局(FDA)批准的人造组织。它最初用于治疗腿部溃疡，也可用于治疗足部溃疡和烧伤。,44,人工皮肤,一种能够使膝关节软骨再生的产品已经面市。已为一个男孩培养了一个胸廓，并在裸鼠身上制造出了人耳。,45,人工软骨人耳鼠,2001.8.，德国杜塞尓多夫大学医院施特劳尓教授等宣布：从心肌梗塞患者的脊椎中