ABI荧光定量PCR中文说明书与培训资料 ABI Prism7300安装培训.ppt

ABIPrism7300/7500实时定量PCR仪用户培训讲义,美国应用生物系统中国公司广州代表处,2005年,用户培训流程：,4、报修请拨打全国的维护中心电话：8008100192。,1、安装完毕，工程师按照SOP培训仪器和软件的操作；,2、具备一定经验的用户，建议参加AB公司的培训班，接受应用及故障排除培训；,培训班在北京、上海、广州等地定期举行，每台仪器有两个免费名额；培训班日程表每半年更新一次，可以到AB公司的网站上查询：。,3、鼓励用户与AB公司的应用专家直接联系，协商进行现场标准品和未知样品的实验培训；,AB产品线的联系方法：陈云地407，8008203939chenyd,培训内容,定量PCR的化学原理,传统PCR的过程：,三个步骤,一、变性：DNA双链结构被分开；94C-96C,二、复性：引物结合到DNA链上；40C-65C,三、延伸：新DNA合成。72C,传统PCR的过程：,2,4,8,16,传统的检测方法使用的是“终点法”：即在反映完成以后再进行检测，如跑胶。,传统PCR的检测方法：,实时荧光定量PCR,实时,每个循环进行测量。,荧光,在反应体系中加入某些荧光物质，荧光物质所发出的信号的强度与体系中的DNA的多少有一定的对应关系，并且信号强度能随着体系中的DNA浓度的改变而改变。,PCR,类似于传统的PCR。,入射光,染料分子,出射光,荧光物质在接受了外界光的照射后，能够向外发射波长比入射光长的光,探针法：,HighEnergymolecule,Lowenergymolecule,能量不同的两个染料分子在空间距离上很接近时，在受到外界光照射的时候，能量高的分子就会将吸收到的能量转移至能量低的分子，使本身能量降低。由于本身能量已经降低，高能的分子就不会向外发光，所以，对于高能分子来说，光就好像是被淬灭了一样。,能量转移：,探针法：,HighEnergymolecule,Lowenergymolecule,探针法：,当两个染料分子在空间位置上距离很远时，能量高的分子所吸收的能量就不能转移至能量低的分子上，这样，两个分子就会各自向外发出自己特定波长的光。,探针：,一段DNA序列，能完全跟实验的目标DNA中的一段互补，两端标上染料分子。,探针法：,每产生一个新的片段，就产生一个荧光分子,探针法：,1,2,4,8,荧光值的不断增加，代表着体系里面的DNA量越来越多。,染料法：,染料法的优缺点：,实时定量PCR的结果计算,所有的样品里的DNA的量都是在按每个循环两倍的速度增加；,当所有的样品的报告荧光的强度都达到某一个数值时，各个样品所经历过的循环数与样品的起始浓度有关，起始浓度越高，所经历的循环次数越少。,未知样品1：,未知样品2：,已知浓度的样品1：,已知浓度的样品2：,已知浓度的样品3：,已知浓度的样品4：,已知浓度的样品5：,1250,2500,5000,10000,20000,？,？,各个样品的荧光值都达到“200000”时所经过的循环数：,14,15,16,17,18,15,17,浓度,例子：,循环数,浓度,lg1250,lg2500,lg5000,lg10000,lg20000,14,15,16,17,18,15,lg10000,17,lg2500,例子：,通过标准曲线，我们可以算出未知样品的起始浓度是：,未知样品1：,未知样品2：,2500,10000,15,17,例子：,ABIPrism7300,7300的功能一览：,光源,入射光滤光片,半透镜,样品架,四色滤光片组,检测器,7300光路图,光源,入射光滤光片,半透镜,样品架,五色滤光片组,检测器,7500光路图,7300选用的荧光组合,每个循环，仪器都会对透过四个滤光片的能量进行读数，得到原始数据：,电脑对原始数据进行处理，得到各种颜色的光的信号强度数据：,Ct,定义好了基线的start和endcycle，threshold后，软件对每个样品进行分析，得到了各个样品的Ct值。,线性图谱