QPCR技术细节ppt课件

.,1,程涛中国科学院生物化学与细胞生物学研究所,细节决定成败QPCR的技术细节对实验结果的影响,.,2,内容概要,.,3,实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析,与常规PCR技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测,荧光定量PCR原理,.,4,扩增曲线荧光阈值Ct值,荧光定量PCR原理,.,5,在PCR反应中，DNA扩增过程遵循酶的催化动力学原理。反应初期，目的DNA片段呈指数扩增。随着目的DNA产物逐渐积累，在引物一模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和，此时扩增DNA片段的增加减慢进入相对稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩增效率、DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产物的竞争等因素。到达平台期前，TaqDNA聚合酶一般要进行25次以上PCR循环。多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。,PCR产物的积累规律,.,6,PCR产物的积累规律示意图,.,7,荧光定量PCR定量原理,扩增曲线,.,8,荧光定量PCR定量原理,为什么终点定量不准确呢？,.,9,荧光定量PCR定量原理,尽管终点产物的量不恒定，但人们发现Ct（cyclethreshold）与模板起始浓度有密切联系。,.,10,Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数,Cycle（循环数）,Rn（荧光强度）,Ctvalue,荧光定量PCR原理Ct值,.,11,前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）荧光阈值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段真正的信号:荧光信号超过阈值,荧光定量PCR原理荧光阈值,.,12,定量PCR的数学原理,.,13,定量PCR的数学原理,.,14,定量PCR的数学原理,.,15,定量PCR的数学原理,模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。,.,16,线性关系、扩增效率确认,检测灵敏度确认,NoTemplateControl(NTC)确认,PCR扩增效率（E）:0.9-1.1,35Cycles内可得到好的定量结果如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增,35Cycles内无引物二聚体产生,相关系数（r2）：大于0.98,荧光定量PCR反应性的确认,.,17,内容概要,.,18,非特异性荧光标记SYBRGreenI特异性荧光标记TaqManProbe,常用荧光标记方法,.,19,SYBRGreenI染料法原理,SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。,SYBRGreenI,.,20,热变性,引物退火,延伸反应,SYBRGreenI染料法作用机理,.,21,问题点：SYBRGreenI与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测到，从而可能导致检测结果不准确。,SYBRGreenI染料法问题点与关键点,关键点：设计合适引物，防止非特异性扩增！,.,22,将温度与荧光强度的变化求导(-dI/dT),原始图谱,对数图谱,SYBRGreenI染料法融解曲线,.,23,SYBRGreenI染料法融解曲线,.,24,对DNA模板没有选择性使用方便，不必设计复杂探针具有价格优势,优点,容易产生假阳性对引物特异性要求较高不能进行多重定量,缺点,SYBRGreenI染料法优缺点,.,25,Taqman探针法原理,5端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等3端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光Taq酶有53外切核酸酶活性，可水解探针,.,26,Taqman探针法工作机理,.,27,1、引物、探针的设计：探针Tm为68-70，30bp,5不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段400bp，引物Tm为59-602、反应参数的确定：一般为：94，10-20S60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60最高），也可通过温度梯度优化退火温度3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值引物浓度：50-900nM探针浓度：50-250nM4、其他与常规PCR相同,Taqman探针法PCR体系的建立,.,28,Taqman探针法荧光标记物的选择,.,29,高度特异性重复性好可进行多重定量,优点,只适合一个特定的目标委托公司标记，价格较高不易找到本底低的探针,缺点,Taqman探针法优缺点,.,30,不同定量方法的比较,.,31,.,32,SYBR法实验流程及注意事项,样品制备,模板准备,引物设计,反应条件优化,浓度确定,技能要求,环境要求,误差控制,数据分析,仪器软件,RT,上机,反应体系优化,试剂选择,分析方法,.,33,样品制备,环境要求,模板准备,数据分析,RT,上机,浓度确定,SYBR法实验流程及注意事项,.,34,RT,反应体系优化,试剂选择,样品制备,模板准备,数据分析,上机,SYBR法实验流程及注意事项,.,35,模板准备,引物设计,浓度确定,环境要求,误差控制,RT,样品制备,数据分析,上机,.,36,反应体系优化,上机,反应条件优化,RT,样品制备,模板准备,数据分析,SYBR法实验流程及注意事项,标准品,待测样本,阳性对照,阴性对照,.,37,技能要求,误差控制,上机,试剂选择,RT,样品制备,模板准备,数据分析,SYBR法实验流程及注意事项,.,38,溶解曲线,扩增曲线,1.95oCfor15min2.94oCfor10sec3.Gradientfrom45oCto65oCfor15sec4.72oCfor30sec5.83oCfor1sec6.PlateRead7.Gotoline239moretimes8.Meltingcurvefrom65oCto95oC,readevery0.2oC,hold1sec.,Real-timePCR体系优化,.,39,误差分析及操作规范,同一cDNA样品的三个重复,.,40,误差分析及操作规范,如图一系列梯度稀释的模板，理论上它们在扩增曲线上的CT值之差，应该相等，但是后边几个浓度低的样品CT值明显提前了，由熔解曲线可知对于浓度低的样品，引物二聚体引起的误差非常严重。,1.模板浓度越低，染料法的误差越大,.,41,误差分析及操作规范,2.某一孔荧光信号特别强,原因：试剂配制时反应液没完全溶化，导致探针量在一管中增多；试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同；也可能是PCR仪热槽被荧光物质污染，这时就要清除热槽中的污染；,.,42,3.样品浓度跨度过大,样品浓度过高，至阳性样品扩增曲线在后面循环中呈一向下的直线，,误差分析及操作规范,.,43,4.部分样本扩增效率过低,原因：提取液残留，一定程度抑制了PCR反应；反应液未严格取量混匀或分装不均匀；试剂失效；,误差分析及操作规范,.,44,5.阴性对照或空白对照翘尾,原因：模板提取环境有污染；模板提取操作有污染；试剂配制过程存在污染；,误差分析及操作规范,.,45,6.直线型扩增曲线,原因：探针部分降解（探针降解原因：a.探针反复冻融稀释的探针可在4保存至少3个月，应避免反复冻融；b.探针在光线下暴露时间太长）；反应液中有PCR抑制物；,误差分析及操作规范,.,46,7.山坡形曲线,原因：常因反应管封口不严，至反应液蒸发所致。,误差分析及操作规范,.,47,8.扩增曲线断裂,原因：基线选取范围不对，基线终点大于Ct值，这通常是由于模板DNA浓度过高所致，因Ct值15，而基线范围仍取315，其中包含部分扩增信号，导致标准差偏大，阈值过高，解决办法：减少基线终点至Ct值前4个循环，重新分析数据,误差分析及操作规范,.,48,9.基线下滑,原因：基线选取范围不对，可试着将基线范围改大一些，这一问题常因试剂质量所致；,误差分析及操作规范,.,49,10.没有扩增曲线,原因：PCR参数设置错误，在设计循环参数时将荧光信号读取时间设在反应的第一步，即stage1阶段；电脑设定了自动休眠；,误差分析及操作规范,.,50,11.扩增曲线有一向上或向下的尖峰,原因：反应过程中电压不稳定；可能在20循环左右仪器有停下或者仪器有开盖，使得光线突然增强；如果尖峰向下，也可能是卤素灯老化所致，这时应更换；,误差分析及操作规范,.,51,数据分析,软件系统,分析方法,上机,RT,样品制备,模板准备,相对定量：2Ct法绝对定量：标准曲线法,可靠，准确的数据,SYBR法实验流程及注意事项,.,52,内容概要,.,53,绝对定量解析方法,.,54,绝对定量的定义,Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量,.,55,质粒标准品的制备,.,56,拷贝数的计算：待测样本浓度（ng/ul）OD26040稀释倍数样本分子量=碱基数324待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量61014,倍比梯度稀释方法：1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v,质粒标准品稀释方法与拷贝数计算,.,57,方法：从组织中提取RNA并进行反转录，以SYBR法进行荧光定量检测试剂：DBI公司SYBRrealtimePCR试剂标准品：质粒标准品浓度为106、105、104、103；2个重复；设阴性空白对照实验步骤：提取RNA并反转录；设计特异引物；荧光定量扩增；结果分析：获取样品中目的基因的精确copy数。,绝对定量实验例,.,58,实验数据,绝对定量实验例,.,59,扩增效率（E）计算E=10-1/斜率1=10-1/-3.171=2.0311.03,标准曲线制作：利用MeanCt作图可得到标准曲线,y=-3.17x+37.52R2=0.9988,绝对定量实验例,相关系数（R2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。扩增效率（E）：0.9-1.1,越接近1，越理想。,.,60,未知样品拷贝数的计算,将Ct值带入线性方程：,20.5=-3.1726X+37.52,QuantityUnknown=105.36=229087copies,绝对定量实验例,.,61,相对定量解析方法,.,62,相对定量的必要性,.,63,以上条件不可能同时得到满足，必须用内对照基因（管家基因）进行校正，进行相对表达量分析。,.,64,管家基因维持细胞基本代谢活动所必须的基因,如：GAPDH、Actin、18SrRNA等,筛选方法,根据文献提供通过具体实验筛选,相对定量分析管家基因筛选,.,65,双标准曲线法2-Ct法,相对定量分析两种常用的分析方法,.,66,通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。,相对值=,校正值=,目的基因定量结果,管家基因定量结果,待测样品的校正值,对照样品的校正值,相对定量分析双标准曲线法,公式：,.,67,优点：分析简单，实验优化相对简单缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一,相对定量分析双标准曲线法,实验数据,.,68,公式：,F=,2,相对定量分析2-Ct法,优点：无需作标准曲线缺点：假定扩增效率为100%；假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致；实验条件优化较为复杂应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一,.,69,实验数据：,Sample,处理前,处理后,Jun(MeanCt),GAPDH(MeanCt),E,1816,1717.4,1.951.95,2-Ct法：假设目的基因和参照基因扩增效率都接近100%,Ct（处理前）18171Ct（处理后）1617.4=1.4Ct=Ct（处理后）Ct（处理前）1.412.4比率（处理后/处理前）=2Ct2（2.4）=5.3所以Jun基因在处理后表达水平比处理前高5.3倍,相对定量分析2-Ct法,.,70,.,71,.,72,发表文章,ActivationofVascularEndothelialGrowthFactorReceptor-3inMacrophagesRestrainsTLR4-NF-BSignalingandProtectsagainstEndotoxinShock.Immunity.(2014)(影响因子：20.72)HCV-InducedmiR-21ContributestoEvasionofHostImmuneSystembyTargetingMyD88andIRAK1.PlosPathog.(2013)(影响因子：9.12)InhibitionofLysylOxidaseAmelioratesInflammationandExperimentalPulmonaryFibrosis.JMOLCELLBIOL.(2014)(影响因子：7.31)ExogenousMelatoninModulatesApoptosisintheMouseB