MSI检测技术ppt课件

.,1,MSI检测技术,.,2,微卫星简要介绍现用微卫星检测技术流程多重荧光PCR技术概略介绍毛细管电泳概略介绍微卫星检测的临床检测可行性,MSI检测技术摘要,.,3,MS,Simplerepeatsequencesof1to6basepairs单核苷酸型:AAAAAAAA.双核苷酸型:ATATATAT.三核苷酸型:ATCATCATC.,.,4,MS,Pronetoreplicationerrors,DefectionofMMR,MSinstability,LS,SporadicMSI,LS,.,5,MS,错误产生机制,Stutter又被称为影子带，或者DNA聚合酶滑脱产物。表现为PCR产物比主要扩增产物增加或减少一个或几个重复单位。,.,6,MSIMAKERSINLS,NationalCancerInstitutesponsoredworkshopin19972mononucleotiderepeats(BAT25andBAT26)3dinucleotiderepeats(D2S123,D5S346,andD17S250)Revisedin20025mononucleotiderepeats(BAT25,BAT26,NR-21,NR-22,andNR-24)PromegaMSIAnalysisSystem5mononucleotiderepeats(BAT25,BAT26,MONO-27,NR-21andNR-24）2pentanucleotiderepeats(Penta-CandPenta-D),criteria,MSI-HReplicationerrors2makersMSI-L1MSS0,.,7,实验流程,1、基因DNA的提取2、多重荧光PCR3、毛细管电泳检测4、分析数据,.,8,基因DNA的提取流程,Promega试剂盒法,分别挑选正常、肿瘤组织,显微切割,.,9,多重荧光PCR,DiseaseMarkers20(2004)237250JefferyW.Bacher,LauraA.Flanagan,上游引物的5端作荧光标记,JOEGreenFLBlueTMRBlack,.,10,多重荧光PCR,PCR反应体系（25l）：2.5lGoldSTR10XBuffer0.1-1Meachprimers0.05lAmpliTaqGoldDNAPolymerase(5Units/l)1-2ngDNAPCR条件：1cycle95Cfor11minutes;1cycle96Cfor1minute;10cycles94Cfor30sec-onds,ramp6secondsto56C,holdfor30seconds,ramp50secondsto70C,holdfor45seconds;20cyclesat90Cfor30seconds,ramp60secondsto56C,holdfor30seconds,ramp50secondsto70C,holdfor45seconds;60Cfor30minutesfinalextension;4Chold.,DiseaseMarkers20(2004)237250JefferyW.Bacher,LauraA.Flanagan,.,11,毛细管电泳检测、分析,微卫星位点经过荧光标记PCR扩增后，取适量PCR产物、分子内标(ILS600)溶于缓冲液（甲酰胺）中经遗传分析仪毛细管电泳进行扫描，通过检测片段长度来判断微卫星不稳定性。利用Genescan和Genetyper软件进行图像收集和分析，计算出微卫星等位变异扩增片段的大小。,PromegaMSIAnalysisSystem,Version1.2,.,12,横坐标代表片段长度纵坐标代表荧光强度,.,13,多重荧光PCR优点,多重PCR技术是指在一个单一反应体系中加入一对以上的特异引物对，同时扩增多个序列，从而产生高度特异性的反应过程，该技术对DNA模板要求量小、高通量分析且省时、省力、省材。应用不同荧光标记可以解决不同PCR扩增位点长度的重叠，极大的提高效率。,.,14,多重荧光PCR前提条件,所有引物对的退火温度必须接近；在同一反应体系中，所有引物对之间不能有相互作用（形成引物寡聚体）；同色引物扩增产物应长度有别，这样才可同时对多个位点进行片段分析。,.,15,毛细管电泳,清洗毛细管,更换电泳缓冲液,进样,电泳并同时在线检测,操作步骤,.,16,毛细管电泳优点,荧光标记毛细管电泳(FCE)快速、准确、敏感性强、可重复性好、结果易分析、高通量检测、客观性强聚丙烯凝胶电泳加放射显影或银染(传统方法）费时、步骤繁琐、判断结果主观性较强,.,17,MSI直肠癌的临床检测可行性,99%con-cordancewithIHCNearly100%accuracyLowercostbacauseoftheuseofasinglemultiplexfluorescentMSIassayFindoutthosemisclassifiedonlybasedonIHC(about5%MSI-HtumorshadnormallevelsoffourMMRproteins),DiseaseMarkers20(2004)237250JefferyW.Bacher,LauraA.Flanagan,.,18,.,19,关于突变的一些概念,Germlinemutation：由父母传给后代的突变，由于此种突变发生在精细胞和卵细胞中，故称为生殖系突变。Consititutivemutation:突变发生在配子或合子过程中，并且这种突变在合子分裂过程中得以保