生物化学-有动画PPT课件

.,1,教师：李伟国资料收集：杨延玺易胜王涛则巴古力董兴冯莹赖照明刘亚京资料整合：杨林芳吴菲菲余星星PPT制作：刘亮讲课：曾栋梁,生物化学实验设计报告蛋白质的提取、纯化以及检测,.,2,已知某蛋白的分子量约为17kDa，等电点3.94.1，它能耐一定的高温，在90C加热34min后仍然能够保持80%的活性。该蛋白含有较多的疏水性残基，与Ca2+结合后可以暴露它的疏水基团。该蛋白的作用是作为生物体内酶的激活剂。,题目解析,在钙离子的作用下才能起到暴露疏水集团发挥性能，结合蛋白质基础知识从而可以判断其为钙调蛋白。,钙调蛋白的简单介绍,钙调蛋白（英语：Calmodulin，又称钙调素、携钙素，简称CaM），是一种能与钙离子结合的蛋白质，普遍存在真核生物细胞中。钙调素由148个氨基酸组成（分子量为16700）；含有大量酸性氨基酸（有1/3是谷氨酸和天冬氨酸），为酸性蛋白质（等电点为4.3）。钙调素含有4个EF手结构片断，其中每一个都可以结合一个钙离子。钙调蛋白是一种钙结合蛋白，存在于几乎所有的真核细胞中。它的作用是对任何微量的钙都能敏感地捕获。钙调蛋白只有在与Ca2+结合后才有活性。与钙结合后，CaM发生构型上的变化，成为一些酶的激活物。因不含有易氧化的络氨酸、半胱氨酸，因此十分的稳定,实验设计框架,实验方法：热变性吸附层析法，基因重组大肠杆菌法（论文无法下载）,蛋白检测：分为定性检测和活性检测,实验总结：总结当前实验,第18卷第4期JournalofShanxiTeachersUniversityVol.18No.42004年12月NaturalScienceEdition动物脑组织中钙调蛋白的分离纯化袁丽环,段江燕,实验方法,试剂准备：新鲜鼠脑；标准钙调蛋白；PDE；Pipes；BufferA：10mmol/LPipes,1mmol/LEDTA,pH=7.0;BufferB：10mmol/LPipes,1mmol/LCaCl2,pH=7.0;BufferC：50mmol/LTris-HCl,0.5mmol/LNaCl,10mmol/LEDTA,pH=8.0;测定Buffer：360mmol/LTris-HCl，360mmol/L咪唑，4.5mmol/LMgAc2。,实验方法,仪器准备：TGL-16L-A高速冷冻离心机；2001-B-C七件套豪华层析系统；UV-2201紫外分光光度计。,钙调蛋白的粗提取,取新鲜的鼠脑共20g，切碎并于100mLBufferA中匀浆将匀浆液置100水浴中煮沸3min，冷却后离心10000rpm，60min.取上清液调成2mmol/LCaCl2溶液。,取样，采用离心法：,钙调蛋白提取,粗样品的纯化：（吸附层析法）,装柱：采用葡聚糖G-50(分离蛋白质的范围在1.5103-3104)用蒸馏水浸充分膨胀(3h-4h)后再装柱；平衡：用提取钙调蛋白的缓冲溶液BufferA平衡；上样：经过平衡的凝胶过滤柱。当平衡液流动到与固定相表面一致时，用滴管轻轻地把分离样品的溶液加到固定相表面，要尽量避免冲毁基质加入样品液的体积一般应少于床体积的1/2;洗脱：待样品液的液面流到固定相表面时，用50mLBufferB淋洗之后用200mL0.5mol/LNaCl的BufferB淋洗，最后用BufferC洗脱；收集：在进行洗脱的同时柱的下端与部分收集器接通。按时间分管收集，每管滴2min，流速控制在大约1.5mL/min。,.,9,钙调蛋白的定性检测,如图，倘若两者最大吸收峰以及峰形基本重合，那么可以判断该物质即为钙调蛋白,采用紫外光谱法：,.,10,钙调蛋白的活性检测,根据磷酸二酯酶(PDE)可特异地把环核苷酸水解为5-核苷酸,并在蛇毒中的核苷酸作用下,进一步水解成腺苷和磷酸.而钙调蛋白可以激活PDE,从而使最终的产物无机磷的量增加,因此可依据磷的含量判断钙调蛋白的生物学活性.,机理图如下,对活性的计算存在以下定量关系：,采用PDE法：,.,11,实验总结,.,12,本文通过动物脑组织为材料经热变性、离心、葡聚糖SephadexG-50分离纯化，通过紫外吸收图谱、二步酶解法检