第七章之细胞破碎.ppt

生物制药工艺学,细胞破碎技术,生物分离过程的一般流程,不同类型的细胞分泌目标产物的类型：,动物细胞：大多无细胞壁，其培养产物大多分泌在培养液中。植物细胞：多为胞内产物。微生物：大多数小分子代谢产物分泌在胞外；大多数大分子产物和基因重组产物为胞内产物，如胰岛素、干扰素、白细胞介素-2等均为胞内产物。对于胞内产物，首先必须将细胞破碎，使产物得以释放，才能进一步提取。,细胞破碎的意义,细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型成分的基础。有效的细胞破碎对分离和纯化任何细胞内活性药物成分都是必要的。细胞破碎与上游和下游工艺设计的关系上游通过细胞的生理状态对细胞破碎效果产生影响；而下游则要考虑去除细胞碎片和细胞蛋白质的污染等对产品活性的影响。细胞破碎过程中必须考虑的因素细胞壁的坚韧程度、目标产品的性质、破碎的规模、方法、费用等.,细胞壁结构对破碎的影响,微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。,细胞破碎是为了破坏细胞外围使细胞内含物释放出来。生物的细胞外围通常包括细胞壁和细胞膜。细胞膜使细胞内外保持一定的浓度差，它主要由蛋白质和脂质组成，强度比较差，易受渗透压冲击而破碎。植物和微生物细胞有细胞壁，细胞壁维持细胞坚固。细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁。,细胞壁的组成与结构,微生物细胞的外围通常包括细胞壁和细胞膜。细胞壁（外壁）：具有固定细胞外形和保护细胞免受机械损伤的功能；细胞膜（内壁）：具有高度选择性的半透膜，控制胞内外一些物质的交换渗透作用。细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁，不同类型的微生物其细胞壁的结构特性是不同的，取决于遗传和环境因素。,研磨,细胞破碎技术,破碎方式,机械法,非机械法,固体剪切作用,液体剪切作用,干燥处理,溶胞作用,磨珠法,高压匀浆,超声破碎,酶溶法,化学法,物理法,机械破碎,捣碎法研磨法匀浆法超声法,物理破碎,温度差破碎法压力差破碎法,化学破碎,有机溶剂：表面活性剂：酸碱,酶促破碎,自溶法外加酶制剂法,通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。,通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。,通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎,通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎,细胞破碎方法及其原理,影响破碎难易程度的重要因素：,机械法细胞的大小和形状、细胞壁厚度、聚合物交联程度。显然，细胞个体小、球形、壁厚、聚合物交联程度高是最难破碎的。（破碎细胞）非机械法细胞壁、膜的组成和结构。了解细胞壁的组成和结构，就可选择合适的溶菌酶和化学试剂，以及在使用多种酶或化学试剂相结合时确定其使用的顺序。（溶解壁膜上的某些组成打洞）,机械法,组织匀浆机,高速组织捣碎机,采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成）。,1.高压匀浆法（High-pressurehomogenization）,细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了高速剪切、碰撞及压力骤降，造成细胞破碎。,高压匀浆阀结构示意图,进液口,出液口,阀座,碰撞环,阀杆,高压匀浆器,19.6-25.4MPa,适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎,大、中、小型高压匀浆器,实验室级高压均质仪,高压细胞破碎机,高压匀浆法使用时注意事项,高压匀浆器的操作温度上升约-3/10MPa为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在20左右。可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式。在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。,高压匀浆法适用的范围,大规模细胞破碎的常用方法高压匀浆法适用的范围：酵母和大多数细菌细胞的破碎；料液细胞浓度可以很高，20%左右。不宜使用高压匀浆法。易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌，含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）,影响高压匀浆器细胞破碎因素,被破碎的细胞分率符合如下公式：ln1/(1-R)=KNP式中R破碎率，为N次循环后，蛋白质的释放量Rn与最大释放量Rm之比；K与温度有关的速度常数；P操作压力，MPa；与微生物种类有关的常数。,升高压力有利于破碎减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达到几乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小。但p大到一定值时对匀浆器的磨损增加，也有实验表明p超生一定值时，R增加但很慢。在工业生产中，通常采用的压力为5570Mpa。破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎，生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基上容易破碎。,影响高压匀浆器细胞破碎因素,高压匀浆法-X-挤压器,改进的高压方法：将浓缩的菌体悬液冷却至-25至-30形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体在受压时的相变，包埋在冰中的细胞变形所引起的。主要用于实验室中。优点是适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高对冷冻一融解敏感的生化物质不适用。,2、珠磨法beadmill,珠磨是常用的方法细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在工业规模的破碎中，常采用高速珠磨机,WSK卧式高效全能珠磨机,高速珠磨机工作原理,磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上的园盘搅拌器高速旋转，使细胞悬浮液和玻离小珠相互搅动；细胞破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料滚动引起在出口处，旋转园盘和出口平板之间的狭缝很小，可阻挡玻离小珠，使不被料液带出。由于操作过程中会产生热量，故磨室还装有冷却夹套，以冷却细胞悬浮液和玻离小珠。,玻璃珠,氧化锆,几种常见珠磨器,珠磨式组织研磨器,利用微细玻璃珠，在高速运转下的相互碰撞，造成组织细胞的破裂与分散。适合珍贵样品液的研磨，例如蛋白质、酶及细胞液等。微细玻璃珠可回收使用。样品处理量，含玻璃珠可达350ml。样品量可达80g,小型珠磨器,密闭容器可容纳1至1.5ml的组织液或是一些细胞悬浊液，通过1至3分钟的剧烈搅拌，能使细胞彻底的破裂，甚至一些骨头、微生物的孢子通过玻璃珠的研磨也能有效的磨碎。玻璃珠适用性：细菌用0.1mm的玻璃珠酵母、藻类和组织培养细胞用0.5mm的玻璃珠动植物的组织用1mm的玻璃珠,WSK卧式高效全能珠磨机,ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机,NetzschLM-20型珠磨机,A-具有冷却夹套的圆筒形磨室B-具有冷却装置的搅拌轴和圆盘C-环形震动侠缝分离器D-变速马达1和2料液进出口3和4搅拌冷却剂进出口5和6磨室冷却剂进出口,园盘以两种位置交错地安装在轴上，一种处于径向，一种与轴倾斜，径向盘使磨料沿径向运动，倾斜盘则产生轴向运动。由于交错的运动，提高了破碎效率。,珠磨机破碎作用方程,破碎作用是相对于时间的一级反应速度过程，符合下列公式：ln1/(1-R)=Kt15-2R破碎率；K一一级反应速度常数；t一时间。K与搅拌转速、细胞悬浮液浓度和循环速度、玻璃小珠装量和珠体直径，以及温度等相关。,珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。,影响破碎效果的因素,影响因素：珠体的直径、进入珠磨机的细胞浓度、料液的流速、搅拌器的转速和构型、温度等。珠体的大小：应根据细胞大小和浓度以及在连续流动的操作过程中不使珠体带出来选择。,珠体的装量：影响破碎程度和所需能量。搅拌速度：增加搅拌速度能提高破碎效率，但过高的速度反而会使破碎率降低，能量消耗增大，所以搅拌转速应适当。,采用夹套冷却的方式实现温控,效果较好;能耗与细胞破碎率成正比;,问题：高压匀浆比珠磨法破碎细胞的效果好？,温控和能耗,高压匀浆法与高速珠磨法的比较,3、超声破碎,机理：声频高于1520kHz的超声波在高强度声能输入时可以进行细胞破碎，破碎机理尚未清楚，可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关。破碎效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型等因素有关。优点：操作简便，液量损失少存在问题：使敏感物质变性失活，噪声大，大容量时效率低，应用潜力有限。,空化现象：在强声波作用下，引起气泡形成，胀大和破碎的现象。,锡箔纸测试空化强度与空化密度,看得到的空化现象,46,JY92-IID超声波细胞粉碎机,一般认为在超声波作用下液体发生空化作用（cavitation),液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或外部冷却的容器中进行。,超声波破碎的适用范围,超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。超声波破碎的有效能量利用率极低由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，但在实验室小规模细胞破碎中常用。,实验室连续破碎池结构示意图,超声波破碎仪,大功率超声波破碎仪,非机械法,非机械破碎方法,酶溶破碎法（enzymelysis）化学破碎法（chemicaltreatment）去垢剂破碎法（detergents）渗透压冲击破碎法（osmoticshock）冻融破碎法（freezingandthawing）,1酶解（酶溶法Enymaticlysis),酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜。（1）外加酶法,溶菌酶主要用于细菌类,外加酶法,酶解法的特点是专一性强，因此在选择酶系统时，必须根据细胞的结构和化学组成来选择。溶菌酶（lysozyme)能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的-1,4糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂EDTA一起使用。放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，所以也能采用溶菌酶，酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。,55,外加酶法,有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加入时需确定相应的次序。对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。,酶解法的特点,优点：发生酶解的条件温和能选择性地释放产物胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整,缺点：溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶)产物抑制的存在。,利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的次序。,诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、激活剂和细胞代谢途径等。缺点是：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。,（2）自溶法（Autolysis）,某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。,2化学渗透法（Chemicalpermeation）,该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。,酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/LHCl。碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。成本低，反应激烈，不具选择性。,（1）酸、碱处理法,细胞破碎常用的表面活性剂：十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）；非离子型如TritonX-100和吐温（Tween）等对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。,（2）表面活性剂,无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型，都是两性的，既能和水作用也能和脂作用，能与细胞壁上的脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解,能分解细胞壁中的磷脂，使细胞结构破坏，胞内物质被释放出来。有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等,（3）有机溶剂,（4）EDTA螯合剂,处理G-细菌，对细胞壁外层有破坏作用。G-细菌的壁外层结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。,通用性差；时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%；有些化学试剂有毒。化学试剂的加入常会给随后产物的纯化带来困难，并影响最终产物纯度,化学渗透法特点：,缺点,对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。,优点,3物理法,渗透压冲击法冻结-融化法干燥法,1）渗透压冲击法,渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。,渗透压,2）冻结-融化法,将细胞放在低温下冷冻（约-15），然后在室温中融化，反复多次而达到破壁作用。一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。,使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-30的气流中吹干；真空干燥多用于细菌。冷冻干燥适用于不稳定的生化物质,3）干燥法,机械破碎法与非机械破碎法的比较,选择破碎方法的依据：,细胞处理量；细胞壁强度和结构(高聚物交联程度、种类和壁厚度)；目标产物对破碎条件的敏感性；破碎程度；目标产物的选择性释放,破碎率的测定,细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。,直接测定法目的产物测定法导电率测定法,采用染色法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。如破碎的革兰氏阳性菌可染成革兰氏阴性菌的颜色；采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫色，而受损害的细胞呈亮红色。,将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中目的产物含量或活性，并与100%破碎率的标准值比较，计算其破碎率。,破碎技术的发展方向,1多种破碎方法相结合机械法与非机械法化学法与酶法多种化学试剂处理多种酶制剂处理,2与上游相结合,（1）寄主细胞的选择：选择较易破壁的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌。（2）培养过程控制：在发酵培养过程的细胞生长的后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑制剂（如青霉素、环丝氨酸等），继续培养一段时间后，新分裂的细胞其细胞壁存在缺陷，利于破碎，而有些胞内产物不经破碎即可直接渗透出来。,（3）克隆噬菌体溶解基因：在细胞内引进噬菌体基因，培养结束后，控制一定条件（如温度等），激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。（4）耐高温产品的基因表达：如果产品能表达成耐高温型，杂蛋白仍然保持原特性，那么就可在较高温度下将产品与杂质分开，这样既节省了冷却费用，又简化了分离步骤。,74,破碎技术研究方向-与下游工程相结合举例：萃取破碎法提取酵母醇脱氢酶,3与下游相结合,细胞破碎与固液分离和产品提取过程相结合，也即根据后处理过程的单元操作确定细胞破碎的方法和操作条件。,包涵体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等。目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性。包涵体的形成：大肠杆菌中目标产物的表达水平过高，超过正常代谢水平，过多表达产物聚集在细胞内，形成不溶性的包涵体。高表达产生的积聚物在细胞内部形成不溶物原因？蛋白过量积聚，超过溶解度，导致沉淀；蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀；蛋白生成太快，分子内部二硫键的错误连接导致沉淀；表达蛋白过多，与其结合/诱导组分不足，不能形成溶解状态蛋白质自身不稳定。,包含体的构成,基因工程包涵体的纯化方法,收集菌体细胞,细胞破碎,包涵体的洗涤,目标蛋白的变性溶解,目标蛋白的复性,包含体的出现不仅增加了生物分离设计的难度，也为蛋白质折叠机理研究提出了新的课题。欲获得天然活性态的目标产物，必需分离包含体后，溶解包含体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。,包涵体获得几种常见的工艺路线(一),机械破碎(高压匀浆、高速珠磨）,离心提取包含体,加变性剂溶解,除变性剂复性,特点:是利用了包含体与细胞碎片的密度差，用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质分开，获得了干净的包含体，