动物组织基因组的提取概要.ppt

实验一、动物组织基因组DNA提取,实验一动物基因组DNA的提取,一、实验目的,学习和掌握从动物组织或细胞中提取核酸的原理和操作技术了解提取DNA的几种方法，原理和优缺点学习测定DNA含量和质量的基本原理及方法,二、实验原理,1、核酸的分类,DNA(脱氧核糖核酸)主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。RNA（核糖核酸）存在于细胞质中，如mRNA,rRNA,tRNA等。除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。,核酸的理化性质,在细胞内通常与蛋白质结合，以复合物形式存在,2、核酸制备的一般原则,微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有机溶剂,在酸性溶液中容易降解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。,DNA溶液粘度很大，RNA的粘度较小,在强大离心力的作用下，可以从溶液中沉降下来,分离纯化核酸总的原则：,2、核酸制备的一般原则,核酸纯化应达到的要求：核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；其它生物大分子的污染应降低到最低程度；排除其它核酸分子的污染。,应保证核酸一级结构的完整性；排除其它分子(蛋白，脂类，多糖类)的污染。,核酸制备时应注意的事项:,尽量简化操作步骤，缩短提取过程。减少化学因素对核酸的降解。减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温防止核酸的生物降解：排除核酸酶。排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。,降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。,核酸酶的抑制和抑制剂,DNase抑制加入少量金属离子螯合剂，如0.01mol/LEDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。,RNase抑制操作要带手套。所有器皿要严格消毒，试剂处理低温操作在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。,常用的RNA酶抑制剂,焦磷酸二乙酯（DEPC）抑制强烈、不彻底异硫氰酸胍有效抑制、分解核蛋白氧钒核糖核苷复合物有效抑制RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）有效抑制其它：SDS、尿素、硅藻土等有效抑制,核酸制备中常用的去垢剂核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂。去垢剂的作用：1溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；2溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；3对RNase、DNase有一定的抑制作用。,如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠,作用：1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。,如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC,核酸制备中常用的蛋白质变性剂,核酸制备中常用的酶DNase:降解DNARNase：降解RNA蛋白酶K：降解蛋白质溶菌酶：破碎细胞,3.核酸制备的一般步骤：,破碎组织细胞,提取,纯化,I.材料准备II.破碎细胞或包膜内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中,1）破碎细胞（防止核酸酶的作用）微生物：溶菌酶、SDS裂解。高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。动物：液氮处理后用匀浆器或者研钵破碎。细胞器DNA：首先纯化细胞器。以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂,2）破碎抽提核酸除去杂质首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它成分分离使核酸与蛋白质分离除去脂类多糖的除去,3）核酸的纯化根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染,并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。,4）核酸样品的保存核酸保存的主要条件是温度和介质温度：4样品经常使用-70是长期保存的良好温度，为一次性保存-20保存,避免反复冻融保存介质：灭菌水TE缓冲溶液(最常用)：10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0,三、动物基因组DNA的提取,主要方法：(1)浓盐法利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离。1）用1M氯化钠提取,得到的DNP粘液2)与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化3)离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中4)用2倍体积95%乙醇可将DNA钠盐沉淀出来.,三、动物基因组DNA的提取,（2）阴离子去污剂法:用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA。由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,而阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA。,三、动物基因组DNA的提取,（3）苯酚抽提法:苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA连接键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA的水相。利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态。,DNA的提取：苯酚抽提法（试剂盒）,1.材料、设备及试剂材料：冷冻或新鲜猪肝组织设备：EP管、微量取液器(20l,200l,1000l)，台式高速离心机，涡旋振荡器试剂：RNaseA、ProteinaseK、LysisBuffer、WashbufferA、WashbufferB、TEbuffer。实验前：WashbufferA中加入18ml无水乙醇，充分混匀；WashbufferB中加入64ml无水乙醇，充分混匀,1）样品预处理取新鲜动物组织25-50mg（组织量不宜过多，否则容易导致裂解不完全而堵塞离心柱），组织剪碎或者切成小块，直接放入匀浆器中匀浆。2）加入600l的LysisBuffer，颠倒充分混匀。如需消化RNA，可加入20lRNaseA，颠倒混匀，室温放置5min。3）加入10lProteinaseK，混匀。56水浴45min-1h，其间颠倒混匀数次直到看到组织完全裂解，裂解完全的标准为液体变得清亮及粘稠。（此步骤可以过夜处理）,2.操作步骤,4）12,000rpm离心10min，将上清转入新的离心管中，加入800l无水乙醇，混匀。5）将液体转入离心柱（一次加不完，可分次转入），12,000rpm离心1min，弃废液。6）加入700lWashbufferA（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm离心30s-1min，弃废液。7）加入700lWashbufferB（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm离心30s-1min，弃废液。,8）加入500lWashbufferB，12,000rpm离心30s-1min，弃废液。9）再次12,000rpm离心2min，将离心柱置于新的离心管中，并打开离心柱盖，于室温或37恒温箱放置510min，直至无明显乙醇味。10）在硅基质膜中央加入50-200lTEbuffer(事先预热55-65)，置于室温2-5min，12,000rpm离心30s。11）离心得到的溶液再次加入离心柱中，室温放置2min，12,000rpm离心2min。所得的溶液为纯化后的基因组DNA。,称取肝脏0.5g,冰冷的生理盐水清洗（3次）,剪碎,5ml生理盐水,匀浆,各组取1/10组织细胞液,移至1.5ml离心管,加600ul,LysisBuffer,加20ul,RNaseA,颠倒混匀，放置5min,加10ul,ProteinaseK,混匀,56水浴，45min,颠倒混匀数次,至液体变清亮及粘稠,12000rpm，10min,离心,取上清转入新离心管,加800ul无水乙醇,混匀,转入离心柱,可分次转入,12000rpm，1min,离心,弃废液，加入700ulWashbufferA,12000rpm，1min,离心,弃废液，加入700ulWashbufferB,12000rpm，1min,离心,弃废液，加入500ulWashbufferB,12000rpm，1min,离心,弃废液,12000rpm，2min,离心,将离心柱置新离心管中，开离心柱盖，放置5min,柱膜中央加100ul,65预热的TEbuffer,放置3min,12000rpm，30sec,离心,取离心后所得溶液再加入离心柱中，放置2min,12000rpm，2min,离心,收集离心后所得溶液，即为纯化后基因组DNA,3.注意事项材料准备,最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集,3.注意事项细胞裂解,材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶K细菌溶菌酶破壁高温温浴时，定时轻柔振荡,3.注意事项核酸分离、纯化,采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法,3.注意事项核酸沉淀、溶解,当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+