第三节 目的基因的获得.ppt

第三节目的基因的获得,目前克隆目的基因常用的方法有四种方法：PCR法、RT-PCR法、CDNA文库法和化学合成法。一、PCR法PCR法用来克隆原核基因和不带内含子的真核基因。,PCR的含义,聚合酶链式反应，其英文PolymeaseChainReaction(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。,PCR的基本原理,试管中进行的DNA复制反应，依据DNA半保留复制的机理；体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质；通过人为控制体外合成系统的温度，使双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。,PCR的反应过程,预变性：使模板DNA的二级结构充分打开，让DNA双链充分解离,为了第一次退火过程时候引物可以尽量多的结合到模板上面。一般的PCR反应的预变性温度是94或95，预变性时间一般设为3-5min。,PCR的反应过程,变性：使DNA双链解离变为单链。一般9495，1min足以使模板变性若低于94则需延长时间但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。,PCR的反应过程,退火(复性)：使引物结合在模板上。退火温度是影响PCR特异性的重要因素。退火温度，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度，一般在40-65之间。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55作为选择最适退火温度的起点较为理想。,引物的复性温度的计算公式,Tm（解链温度）4(G+C)+2(A+T)复性温度=Tm值（510）；在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性；复性时间一般为3060s，足以使引物与模板之间完全结合。,PCR的反应过程,延伸：在DNA聚合酶的催化下，按照碱基互补配对原则不断合成DNA片段。延伸温度：一般选择在7075之间常用温度为72过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够）34kb的靶序列需34min扩增10kb需延伸至15min延伸时间过长会导致非特异性扩增对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些,PCR的反应过程演示,高温变性,低温退火,中温延伸,PCR法克隆基因的技术流程,设计引物,提取基因组DNA,进行PCR反应,进行电泳检测,设计引物,引物设计的原则：（1）序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。,设计引物,（6）引物3端的碱基要求严格配对（不能做任何修饰），5端无严格限制。（7）引物5端可修饰引物5端限定着PCR产物的长度，但对扩增特异性影响不大；引物5端碱基可不与模板DNA互补而呈游离状态；引物5端最多可加10个碱基而对PCR反应无影响。,3,5,3,5,限制性内切酶的识别序列启动子序列定点突变探针标记,提取基因组DNA,模板DNA的来源：微生物中提取DNA植物中提取DNA从细胞中提取DNA：血细胞、绒毛、尿样、毛发、精斑、口腔上皮细胞固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化模板DNA的浓度：0.12ug/100ul体系PCR产量随模板DNA浓度的增加而显著升高模板DNA浓度过高导致非特异性产物增加,进行PCR反应,PCR反应体系与流程,反应体系模板（DNA或RNA）引物TaqDNA聚合酶10PCR缓冲液1.54mMMg2+0.2mMdNTP,反应流程预变性变性退火延伸延伸完全终止,2535循环,进行电泳检测,电泳检测：对PCR的结果进行琼脂糖凝胶电泳检测。（例如下面是VvSUC11基因的电泳结果）,二RT-PCR法,RT-PCR的定义：是将RNA的反转录（reversetranscription）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性和半定量分析的最有效方法。,RT-PCR的过程,试管内逆转录反应,RT-PCR结果的电泳检测,例如下面是基因VvSUC11和VvSUC12的RT-PCR结果：,三CDNA文库法,基因文库(genelibrary):将生物材料的基因组DNA或cDNA片段化，然后与特定的载体连接导入宿主菌形成的包含有目的基因在内的DNA片段的克隆群体（集合）。按照外源DNA片段的来源，基因文库可分为：基因组文库和cDNA文库。基因组文库(genomiclibrary):是指将某生物体的全部基因组DNA用限制酶或机械力切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。,cDNA文库(cDNAlibrary):是指某生物某一发育时期所转录的mRNA全部经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。cDNA文库仅包含所选材料在特定时期表达的基因，且这些基因在表达丰度上存在差异,cDNA文库的构建,1、cDNA文库的构建（1）分离提取细胞总RNA（2）mRNA与其他RNA的分离。mRNA仅占总RNA的12%，可利用mRNApoly(A)与其他RNA分开。,mRNA与其他RNA的分离,(3)以mRNA为模板反转录合成cDNA的第一条链mRNA纯化后，加入oligo(dT)作为引物，以提供3-OH引导DNA链的合成，同时加入逆转录酶和四种dNTP，形成RNA-DNA杂合分子。,以mRNA为模板反转录合成cDNA的第一条链,（4）cDNA第二链的合成自身引导法获得的双链cDNA5端会有几对碱基缺失,（4）cDNA第二链的合成置换合成法获得的双链cDNA5端也会有几对碱基缺失,还会有一小段RNA,但不影响后续的克隆操作。,（4）cDNA第二链的合成引导合成法获得的双链cDNA能保留完整的5端序列,（5）双链cDNA与载体DNA相连平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收（6）重组cDNA分子的转移和文库的建立选用载体为质粒，可直接转化E.coli；若为载体，则需进行体外包装、感染等。,从cDNA文库中筛选目的基因,DNA探针筛选：构建的cDNA文库，每个噬菌斑或菌落中含有一个被克隆的cDNA片段。然后，利用原位DNA探针进行