荧光定量PCR技术

常规PCR中，在扩增反应结束之后，我们一般通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，无法对PCR扩增反应进行实时检测，也无法对起始模板准确定量，而很多情况下，我们所感兴趣的是起始模板量，如转基因动植物中插入某种外源基因的拷贝数或者病人中某种病毒DNA/RNA的精确copy数等，如此，荧光定量PCR技术便应运而生。1、荧光定量PCR概念所谓定量PCR技术（real-time PCR），是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法（如下图）。2、荧光定量PCR与普通PCR的主要区别理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是96次PCR重复实验，各种条件基本一致，所得结果有很大差异（如下图），所以在实验过程中我们不能根据最终PCR产物的量直接计算出起始DNA拷贝数。而从上图我们也可以看出，虽然相同模版在同一台PCR仪上进行96次扩增，终点处检测产物量不恒定，但96次PCR扩增曲线都有一个共同的拐点，而且拐点极具重现性，为荧光定量PCR技术的应用提供了理论基础。3、几个基本概念为了使大家更好的理解、掌握荧光定量PCR技术，接下来有必要向大家介绍几个最基本的概念。3.1扩增曲线为了更好的理解荧光定量PCR原理，我将用样品扩增曲线来进行说明。描述PCR动态进程的曲线即扩增曲线。前面我们也了解到，PCR的扩增曲线实际上并不是一条标准的指数曲线，而是呈S型曲线(如下图)从上图我们可以很直观的看出，荧光定量PCR扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段（基线期），荧光信号指数扩增阶段（对数期）和平台期。在基线期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。32荧光阈值我们一般把荧光PCR的前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline，基线期），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍（机器自动设置）。我们在做荧光定量PCR实验时，经常采用手动设置，手动设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，真正的信号是荧光信号超过域值（如下图）。33 Ct值了解了荧光阈值的概念后，Ct值就很好理解了。C代表Cycle，t代表threshold，所谓Ct值就是在荧光PCR扩增过程中，当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。如上图所示，黑色的线显示的是荧光阈值，当信号超过黑色线时所经历的循环数即为Ct值。因为Ct值即达到荧光阈值所经过的循环数，所以它就与模版的拷贝数存在着线性关系，起始拷贝数越多，经过的循环数就越少，Ct值也就越小，反之亦然。正常的CT值范围在18-30之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。前面也提到过，同一模板经过96次PCR扩增，扩增产物虽然不恒定，但Ct值极具重现性。根据这个特点，我们可以利用已知起始拷贝数的标准样品的Ct值做出标准曲线，只要在同一次PCR实验中得到未知样品的Ct值，就可以根据曲线算出该未知样品的起始拷贝数。34标准曲线在绝对定量实验过程中，我们可以将已知浓度的标准品进行梯度稀释，将未知样品和梯度稀释的标准品在同一荧光PCR实验中进行反应，将稀释标准品得到的Ct值构建标准曲线，通过标准曲线可以推算出未知样品的量（如下图）。荧光定量PCR标准曲线示意图理论上，一系列稀释样品的扩增曲线之间有均匀的间距（上图左），如果PCR反应呈理想的方式扩增，产物在每一循环都加倍，荧光曲线之间的间距则符合等式“2n稀释倍数”，n为2样本间Ct值差。例如：10倍稀释的样本，2n10，可得n3.32，Ct值差3.32。35扩增效率扩增效率与标准曲线的斜率相关，计算方程为：扩增效率（E）10-1/斜率。理论上，在每个指数扩增循环中，PCR产物的量加倍，即PCR产物2倍增加，反应效率为2，扩增效率就为2，就可得210-1/斜率，标准曲线得斜率就为-3.32，斜率得绝对值与荧光曲线间距相同。如果将扩增效率用百分率来表示，即：E%=(E-1)100%，对于理想的PCR反应，E=2，即：扩增效率E%=(2-1)100%=100%如果E1.92，带入方程(1.92-1)100%=92%，表示每个循环的终点，扩增产物的拷贝数增加1.92倍，或每次循环有92的模板被扩增。一般说来，扩增效率接近100是优化的重复性好实验的最好标志，实际操作时，反应的扩增效率应该在90105之间，如果扩增效率低，可能的原因是引物设计不当，或者反应条件未优化；扩增效率大于100时，可能的原因是系列稀释样品加样错误，或者有非特异性产物扩增，如引物二聚体产生。用上述方法确定扩增效率时，反应体系中的抑制剂的出现也可能导致扩增效率明显增加，原因是高浓度模板样本中抑制剂的浓度低，导致反应的Ct值延迟出现，而低浓度模板样本中抑制剂浓度高，反应的Ct值延迟程度小，导致斜率的绝对值以及计算所得的扩增效率会增加。如果扩增效率小于90或大于105，建议重新设计引物或探针。4、荧光定量PCR的方法接下来我们就来了解一下荧光定量的主要方法，我们如何选择合适的方法？荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。而荧光定量 PCR 的方法相应的可分为特异类和非特异类两类，特异性检测方法是在PCR反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物；而非特异性检测方法是在在PCR反应体系中，加入过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射出荧光信号。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。荧光定量PCR最常用的方法是DNA结合染料SYBR Green的非特异性方法和Taqman水解探针的特异性方法，在这里主要介绍这2种方法，其它方法请参考其它荧光定量PCR资料。41非特异性SYBR Green I染料法SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料（结合示意图），在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强（作用机理图）。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。SYBR Green I与DNA双螺旋小沟区域结合示意图SYBR Green I的优点： 实验设计简单，仅需要设计上下游一对引物，不需要设计探针，无需设计多个探针即可快速检验多个基因，通用性好；成本低；能够通过溶解曲线分析检验扩增产物的特异性。因而在低通量实验和单重实验时一般优先考虑使用SYBR Green I染料法。SYBR Green I的缺点：由于 SYBR Green I 与所有的双链 DNA 相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性，SYBR Green I方法对PCR扩增特异性要求较高。实验过程中通过溶解曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBR Green I得到定量结果。另外，因为SYBR Green I 不能区分不同扩增子发出的荧光而导致它不能用于多重反应。溶解曲线分析溶解曲线分析可以用来确定不同的反应产物，包括非特异性产物。扩增反应完成后，通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生溶解曲线，随着反应中双链DNA变性，荧光染料又回复到游离状态导致荧光信号降低，用荧光信号改变的负的一次导数与温度作图，在扩增产物的溶解温度上有一特征峰（Tm，DNA双链解链50的温度），用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开，因为它们在不同的温度溶解（如下图）。42特异性Taqman水解探针法Taqman荧光定量技术是以Taqman荧光探针为基础，Taqman荧光探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。从而实现定量（如下图）。常用的荧光基团是FAM, TET, VIC, HEX。由于Taqman探针法中，除引物外，还使用了一条特异的探针，因此此方法可以特异的检测目标序列，防止非特异产物的干扰影响定量的准确性，同时它也可以用于多重反应，但探针设计成本较高，有时探针设计困难。了解了荧光定量的方法后，下面让我们一起来看看荧光定量的分析方法，我们如何根据我们的实验材料、实验目的来选择合适的分析方法？5、荧光定量分析方法我们在设计实验的时候通常对下列事情更感兴趣：1）测定未知样品的绝对量：如给定的血样中的病毒颗粒数，食品中某一种转基因成分的含量；2）未知样品与已知样品相比，基因的表达量改变了多少倍：如相当量的肿瘤组织和正常组织相比，p53mRNA改变了多少倍。分析这两种假设的方法就分别叫绝对定量和相对定量。绝对定量是通过样品的Ct值和标准曲线进行比较实现的。分析的结果是给定数量的样品中（给定数量的细胞，每微克总RNA）中核酸的量（拷贝数、微克）。相对定量的分析结果是在相当量的试验组（样品A）和对照组（样品B）中一个靶基因的相对比率（倍数差异）。接下来我们就来看看我们在实验过程中如何来使用绝对定量和相对定量的分析方法。51绝对定量分析方法511绝对定量分析方法的使用条件在这里我将举例来说明我们在实验过程中，何种实验需要用绝对定量来进行分析。医生对一个乙肝病人的每毫升血液中HBV DNA的精确拷贝数感兴趣。首先医生要从病人血液中提取DNA，然后通过荧光定量PCR实验来确定HBV病毒DNA的copy数。通过病人样品的Ct值和设置梯度稀释的已知HBV对照样品的标准曲线进行比较，医生就能确定病人血液中HBV病毒DNA的copy数。从这个例子，我们也可以看出，在实验过程中，如果最终的结果是对未知样品的定量描述，并不依赖别的样品的性质的时候，就应该使用绝对定量进行分析。512绝对定量数据处理（举例）：确定某病人的血液提取的HBV病毒的精确量如：PCR反应结束后，我们得到如下数据：copies/ml Ct1 Ct2 Ct3 Mean Ct STD5103 27.61 27.58 27.84 27.67667 0.135104 24.25 24.42 24.55 24.40667 0.085105 21.11 21.04 21.16 21.10333 0.065106 18.05 18.06 18.21 18.10667 0.08BLANK None None None sample 23.25 23.46 23.39 23.36667 0.05注：平行样的Ct值之间的差0.5时表示重复性较好直接从荧光PCR仪上就可以得到标准曲线：从标准曲线可以看出： r20.9995，大于0.98，标准差都在0.2范围内，而E=10-1/-3.2013=2.04，扩增效率（2.041）100%=104%，表示定量准确，可将未知样品的Ct值带入方程：23.36667= -3.2013 X + 30.827可得X2.33所以copies(5104/2) 2.335.825104但我们需要注意的是，标准曲线只可能用于推算稀释梯度范围内的未知样本的量，而不能外推稀释梯度外的未知样本的含量。所以，我们在实验过程中尽可能使未知样品的浓度在标准品的稀释范围内。52相对定量分析方法521相对定量分析方法的使用条件同绝对定量分析类似，我将举例来说明我们在实验过程中何种实验需要用相对定量来进行分析。我们如果想知道经过药物处理过的组织和未处理的组织中某一目的基因的表达水平是否有差异，相差多少倍？我们可以选择以下2种方式：1)我们可以从等量的2种组织中提取RNA，分别进行目的基因的反转录特异性荧光定量PCR实验来确定目的基因在2种组织中的表达量，结果可以反映等量的2种组织中目的基因表达量的比率。2）如果我们之前已经确定2种组织中看家基因如GAPDH的表达量相等，那么，我们就可以从大约等量（不需要等量）的2种组织中分别提取RNA，通过RT-qPCR实验来确定2种组织中目的基因和看见基因的表达水平。药物处理组织的目的基因的表达量可由2种组织中看家基因和未处理组织中目的基因的表达量共同来确定。2种分析方法的差异就在于用的标准有所不同，方法1）中的标准是2种组织的量相等；方法2）中的标准是2种组织中看家基因如GAPDH的表达量恒定不变；522相对定量数据处理（举例2-Ct法）：药物处理后和处理前某组织X基因表达量的变化5221溶解曲线绘制与分析熔解曲线的设置是在整个PCR完成后进行，从60升至95，每升高1仪器会自动收集荧光信号，得到的熔解曲线是逐渐下降的过程，且在Tm值下降最快，为方便分析，我们将温度与荧光强度的变化求导，即得到单峰的熔解曲线，这样我们就可以证明引物的特异性良好，实验结果不受非特异性扩增和引物二聚体的干扰（如下图，左为GAPDH基因，右为X基因）。5222数据处理